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題目：The MdBBX22–miR858–MdMYB9/11/12 module regulates proanthocyanidin biosynthesis in apple peel

刊名：Plant Biotechnology Journal

作者：Bo Zhang, Zheng-Yang Zhao et al.

單位：Northwest A&F University

First published: 08 May 2022?

摘要

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原花青素 (PA) 具有抗氧化特性，對人體健康有益。蘋果 ( Malus ?×? domestica Borkh.) 的果實，尤其是果皮，富含多種類黃酮，如 PAs，是膳食抗氧化劑的重要來源。以往對蘋果PAs調(diào)控的研究主要集中在轉(zhuǎn)錄水平，而在轉(zhuǎn)錄后水平的研究相對較少。在本研究中，研究了蘋果果皮中 mdm-miR858（一種在植物發(fā)育中具有多種功能的 miRNA）的功能。研究者發(fā)現(xiàn) mdm-miR858 通過靶向MdMYB9 / 11 / 12負調(diào)控 PA在果皮中積累。在果實發(fā)育過程中，mdm-miR858表達與MdMYB9 / 11 / 12表達和PA積累呈負相關(guān)。5'-RACE 實驗、GUS 染色測定和瞬時熒光測定表明 mdm-miR858 切割并抑制MdMYB9 / 11 / 12的表達。蘋果愈傷組織、煙草和擬南芥中 mdm-miR858 的過表達減少了由MdMYB9 / 11 / 12過表達誘導(dǎo)的 PA 的積累。此外，研究者發(fā)現(xiàn) MdBBX22 與 mdm-miR858 啟動子結(jié)合并誘導(dǎo)其表達。MdBBX22的過表達誘導(dǎo)mdm-miR858的表達抑制過表達MdMYB9 / 11 / 12的蘋果愈傷組織中PAs的積累。在光脅迫下，MdBBX22 誘導(dǎo) mdm-miR858 表達以抑制 PA 積累，從而間接增強果皮中花青素的合成。目前的結(jié)果表明，MdBBX22–miR858– MdMYB9 / 11 / 12模塊調(diào)節(jié)蘋果中 PA 的積累。該研究結(jié)果為進一步研究PA積累的調(diào)控機制以及PAs與花青素的關(guān)系提供了參考。

技術(shù)路線

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主要結(jié)果

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3.1?蘋果皮發(fā)育過程中mdm-miR858的表達與PA積累呈負相關(guān)

在蘋果'Starkrimson Delicious'果實的果皮發(fā)育過程中，兒茶素、表兒茶素、原花青素B1、原花青素B2和總PAs的含量在開花后30至60天（DAFB）迅速下降，從60至90 DAFB略有增加，隨后下降。（圖?1a,b）。

為了鑒定參與調(diào)節(jié) PA 積累的 miRNA，在 30、60、90、120 和 140 DAFB 收集蘋果皮樣品并用于 sRNA 測序。總共鑒定了 5106 個獨特的成熟 miRNA。所有 miRNA 分為三組：已知 miRNA (617)、保守 miRNA (60) 和新 miRNA (4429)。對這些 miRNA 的表達與總 PA 含量進行了相關(guān)性分析。188 種 miRNA（39 種已知 miRNA、7 種保守 miRNA 和 142 種新 miRNA）的表達與 PA 含量呈負相關(guān)（圖?1c）。對其靶基因的預(yù)測顯示，只有mdm-miR858、MdMYB9的預(yù)測靶基因/11 / 12，參與類黃酮生物合成。基于 sRNA 測序數(shù)據(jù)的 mdm-miR858 的表達模式通過 qRT-PCR 分析的結(jié)果得到驗證（圖?1d，e）。這些結(jié)果表明mdm-miR858可能參與了PA積累的調(diào)節(jié)。

3.2?mdm-miR858 靶向MdMYB9 / 11 / 12抑制蘋果愈傷組織中 PA 的積累

研究者使蘋果皮和蘋果愈傷組織中的?MdMYB9、MdMYB11和MdMYB12沉默。沉默MdMYB9、MdMYB11和MdMYB12分別降低了蘋果皮和蘋果愈傷組織中的總 PA 含量；然而，當(dāng)MdMYB9、MdMYB11和MdMYB12同時沉默時，總 PA 含量下降更顯著。這些結(jié)果表明 MdMYB9、MdMYB11 和 MdMYB12 在調(diào)節(jié) PA 方面具有功能冗余。為了驗證 mdm-miR858 抑制 PA 積累，產(chǎn)生了 MdMYB9 -OX、MdMYB11 -OX 和MdMYB12 -OX 的過表達愈傷組織。在用 4-二甲氨基肉桂醛 (DMACA) 染色后，MdMYB9 -OX、MdMYB11 -OX 和MdMYB12 -OX 愈傷組織被染成紫色（圖?4a）。定量逆轉(zhuǎn)錄 PCR (RT-qPCR) 分析顯示MdMYB9、MdMYB11和MdMYB12在MdMYB9 -OX、MdMYB11 -OX 和MdMYB12中的表達與野生型愈傷組織相比，-OX愈傷組織顯著增加（圖?4b）。HPLC分析表明，MdMYB9-OX、MdMYB11-OX和MdMYB12-OX愈傷組織中兒茶素、表兒茶素、原花青素B1、原花青素B2和總PAs的含量高于野生型愈傷組織（圖?4c）。當(dāng) mdm-miR858 在MdMYB9 -OX、MdMYB11 -OX 和MdMYB12 -OX 愈傷組織中過表達時，MdMYB9、MdMYB11和MdMYB12在 mdm-miR858-OX/ MdMYB9 -OX、mdm- miR858-OX/ MdMYB11中的表達水平顯著降低（圖?4b）。用 DMACA 染色后，mdm-miR858-OX/ MdMYB9 -OX、mdm-miR858-OX/MdMYB11-OX 和mdm -miR858-OX/ MdMYB12 -OX愈傷組織中不存在紫色（圖?4a）。與MdMYB9- OX、MdMYB11- OX和MdMYB12- OX愈傷組織相比，兒茶素、表兒茶素、原花青素B1、原花青素B2和總PA含量顯著降低（圖?4c）。

3.3?MdBBX22誘導(dǎo)mdm-miR858的表達抑制PA積累并改變代謝過程以增強光脅迫下蘋果皮中花青素的合成

MdBBX22 是蘋果中的一種光響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子。這使我們推測 MdBBX22 可能調(diào)節(jié) mdm-miR858 的表達，從而影響光脅迫下的 PA 積累。首先，蘋果果實在 45 DAFB 時被裝袋，在 120 DFAB 時，水果被打開并放置在光照培養(yǎng)箱中暴露在連續(xù)光照下。光脅迫下總 PA 含量降低，而花青素含量增加（圖?8a）。RT-qPCR 分析顯示MdBBX22和mdm-miR858的表達在光脅迫下增加，而MdMYB11和MdMYB12的表達在光脅迫下減少（圖?8b），并且MdMYB9總是表現(xiàn)出低表達水平。這些結(jié)果表明，MdBBX22可能通過在光脅迫下上調(diào)mdm-miR858的表達參與PA的調(diào)節(jié)。

為了驗證 MdBBX22 可以誘導(dǎo) mdm-miR858 的表達以抑制光脅迫下蘋果皮中 PA 的積累，我們在蘋果皮中通過瞬時轉(zhuǎn)化，過表達了 MdBBX22 、MdBBX22 （圖8c），MdBBX22 -OX 蘋果皮?中的花青素含量增加（圖8d，f），而MdMYB11和MdMYB12的過表達系中總 PAs 的含量降低（圖?8e，f），而MdMYB11和MdMYB12的過表達體總 PA 的含量增加（圖?8e，f）。這些結(jié)果表明 MdBBX22 誘導(dǎo) mdm-miR858 的表達以抑制光脅迫下蘋果皮中 PA 的積累。

3.4 mdm-miR858 靶向MdMYB9 / 11 / 12抑制煙草和擬南芥中 PA 積累

為了驗證 mdm-miR858 靶向MdMYB9 / 11 / 12以抑制 PA 積累，研究者在煙草和擬南芥中過表達MdMYB9 / 11 / 12。mdm-miR858-OX/ MdMYB9 -OX、mdm-miR858-OX/ MdMYB11 -OX和mdm-miR858-OX/ MdMYB12 -OX煙草花中花青素含量增加。然而，兒茶素、表兒茶素和總 PA 的含量下降，而其他黃酮醇的含量保持不變。

當(dāng)將MdMYB9 / 11 / 12轉(zhuǎn)移到擬南芥tt2突變體中時，種皮的顏色變?yōu)樽厣?#xff0c;并且 DMACA 將種皮染色為藍黑色（圖?5a）。MdMYB9- OX/ tt2、MdMYB11 -OX/種子中PA含量及MdMYB9、MdMYB11、MdMYB12的相對表達量與tt2突變體相比，tt2和MdMYB12 -OX/ tt2擬南芥顯著增加（圖?5b，c）。當(dāng)mdm-miR858轉(zhuǎn)化為MdMYB9 - OX/ tt2、MdMYB11 -OX/ tt2和MdMYB12 - OX/ tt2擬南芥時，mdm-MIR858（pre-mdm-miR858）和mdm-miR858大量表達（圖?5c)，種皮是淺黃色并且沒有被DMACA染色(圖?5a )。總PAs含量及MdMYB9 / 11/ 12在種子中顯著減少（圖?5b，c）。此外，與擬南芥MdMYB9-OX/ tt2、MdMYB11- OX/ tt2和MdMYB12 -OX/ tt2相比， AtDFR、AtANS和AtANR的表達顯著降低（圖?5d）。

結(jié)論

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總之，本研究表明，mdm-miR858可以靶向MdMYB9 / 11 / 12從而抑制PAs的積累。在光脅迫下，MdBBX22與mdm-miR858啟動子結(jié)合，通過靶向MdMYB9 / 11 / 12誘導(dǎo)mdm-miR858表達抑制PA積累，抑制PA分支促進蘋果果皮中花青素的快速合成。研究結(jié)果揭示了轉(zhuǎn)錄后水平上 PA 合成的新調(diào)控機制。此外，本研究結(jié)果闡明了輕脅迫下蘋果皮中 PAs 和花青素之間的關(guān)系。

獲取原文

5

原文鏈接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.13839

補充材料：

https://onlinelibrary.wiley.com/action/downloadSupplement?doi=10.1111%2Fpbi.13839&file=pbi13839-sup-0001-FigureS1-S14.pdf

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