目錄

前言

一、軟件安裝

二、創建環境及安裝軟件

1.創建環境 chipseq

2.chipseq 環境下安裝軟件

三、具體分析步驟

1.數據來源

2.下載數據并重命名

3.fastq 文件轉換（--sra-id?此步驟把 SRR 的名稱改掉，加快運行速度，速度非常快）

4.質控

4.1 trim_galore

4.2 FastQC質控報告生成（舊的數據）

5.bowtie2比對(15min/file)

6.samtools sam?轉換?bam

6.1view &sort

6.2 index

7.bamCoverage?BW轉換 bam 轉換成 bw

8.IGV查看 bw文件 peak

9.MACS2 callpeak

10.MACS2 差異分析（2021-10-15 待完善）

11.Homer 分析 motif

11.1查看所有的?list:

11.2下載注釋信息

11.3 Create a tag directory

11.4 Differentially Bound Peaks（找差異peak）

11.5?Annotate peaks（Peak注釋）

用 R 把差異peak 和 Peak 注釋合并：fread,merge 函數

11.6 其他功能

12. ROSE 尋找超級增強子 SE（super enhancer）

12.1 參考教程：?ROSE | 超級增強子鑒定

12.2 ROSE 安裝見上

12.3 ROSE 尋找 SE

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前言

自己做筆記自己看的

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一、軟件安裝

? 設備：mac m1 電腦

• 軟件程序安裝
• 參考教程Macbook Pro M1芯片Python開發環境配置_朝歌晚酒南梔雪的博客-CSDN博客
  • xcode
  • item2
  • git
  • homebrew brew install wget #安裝 wget
  • anaconda-pkg

?? ? ? ? ? ? ? ? ? ???????Anaconda | Individual Edition??下載鏈接

? ? ? ? ? ? ? ? ? ?Installing on macOS — Anaconda documentation?幫助鏈接

? ? ? ? ? ? ? ?pycharm CE

二、創建環境及安裝軟件

1.創建環境 chipseq

conda? create -n chipseq? python=3conda activate chipseq #激活環境conda deactivate

2.chipseq 環境下安裝軟件

ps:一項一項安裝，不然容易卡住

conda install -y bioconda parallel-fastq-dump ?#SRR→FASTQ 轉換conda install -y trim-galore #質控conda install -y?bioconda bowtie2 # fastq比對到 hg19brew tap homebrew/science?brew install samtools?#sam 轉化為 bamconda install -y macs2 #峰值定量，差異分析conda install -y conda-forge libgfortran #macs2 差異分析輔助用conda install -y bioconda deeptools #可視化#包含 bamcoveragehttps://deeptools.readthedocs.io/en/latest/content/tools/bamCoverage.htmlIGV 下載https://software.broadinstitute.org/software/igv/download #可視化

ROSE 安裝

https://bitbucket.org/young_computation/rose/src/master/ ROSE 下載 #把所有要處理的文件都放到 rose 文件夾：sorted.bam, bed,bam.bai #創建 Python2.7conda create -n rose python=2.7conda activate rose

Homer安裝

• 公眾號參考?HOMER | chipseq數據進行peaks的差異分析
• homer安裝：?chipseq 環境下，conda install -c bioconda homer
  • 下載configureHomer.pl ?http://homer.ucsd.edu/homer/configureHomer.pl
  • 文件放在想要安裝 homer?的文件夾中，/Users/xusiqi/chip/homer
    • 目錄文件夾中安裝?homer :?

perl configureHomer.pl -installopen -a TextEdit ~/.bash_profilePATH=$PATH:/Users/chucknorris/homer/bin/??#路徑加入到系統路徑中source ~/.bash_profile

• perl?configureHomer.pl -list #查看所有的?list

三、具體分析步驟

1.數據來源

使用數據Wang J, Zou JX, Xue X, Cai D et al.?ROR-γ drives androgen receptor expression and represents a therapeutic target in castration-resistant prostate cancer.?Nat Med?2016 May;22(5):488-96. PMID:?27019329

GSM1868876: C4-2B vehicle Input chip seq; Homo sapiens; ChIP-Seq(SRR2242690) https://trace.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/?run=SRR2242690 GSM1868866: C4-2B vehicle AR chip seq; Homo sapiens; ChIP-Seq(SRR2242680) https://trace.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/?run=SRR2242680

GSM1868862: 2nd time C4-2B vehicle AR chip seq; Homo sapiens; ChIP-Seq(SRR2242676)? https://trace.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/?run=SRR2242676 GSM1868864: 2nd time C4-2B vehicle Input chip seq; Homo sapiens; ChIP-Seq(SRR2242678) https://trace.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/?run=SRR2242678

2.下載數據并重命名

wget https://sra-pub-run-odp.s3.amazonaws.com/sra/SRR8557353/SRR8557353 mv???? SRR8557353????? input.h3k.conwget https://sra-downloadb.be-md.ncbi.nlm.nih.gov/sos3/sra-pub-run-20/SRR8557351/SRR8557351.1 mv? SRR8557351.1?? ip.h3k.conwget https://sra-downloadb.be-md.ncbi.nlm.nih.gov/sos3/sra-pub-run-21/SRR8557354/SRR8557354.1 mv? SRR8557354.1?? input.h3k.xywget https://sra-pub-run-odp.s3.amazonaws.com/sra/SRR8557352/SRR8557352 mv?? SRR8557352???? ip.h3k.xy

3.fastq 文件轉換（--sra-id?此步驟把 SRR 的名稱改掉，加快運行速度，速度非常快）

parallel-fastq-dump —sra-id input.h3k.con —threads 35? —outdir out/ —split-files —gzip parallel-fastq-dump —sra-id ip.h3k.con?? —threads 35? —outdir out/ —split-files —gzip parallel-fastq-dump —sra-id? input.h3k.xy?? —threads 35? —outdir out/ —split-files —gzip parallel-fastq-dump —sra-id?? ip.h3k.xy?? —threads 35? —outdir out/ —split-files —gzip

4.質控

4.1 trim_galore

• trim_galore（只能單線程）
  • Cutadapt:去接頭，去除3端低質量堿基，去除長度太短的序列
    • ????report.txt
    • ????fq.gz(用來比對)

trim_galore input.h3k.con_1.fastq.gz? -q 25 —phred33 —length 25 -e 0.1 —stringency 4 trim_galore input.h3k.xy_1.fastq.gz? -q 25 —phred33 —length 25 -e 0.1 —stringency 4 trim_galore ip.h3k.con_1.fastq.gz? -q 25 —phred33 —length 25 -e 0.1 —stringency 4 trim_galore ip.h3k.xy_1.fastq.gz? -q 25 —phred33 —length 25 -e 0.1 —stringency 4

4.2 FastQC質控報告生成（舊的數據）

• fastqc -o?/Users/xusiqi/CHIP/out?-t 6?/Users/xusiqi/CHIP/out/SRR2242680_1_trimmed.fq.gz
• fastqc -o?/Users/xusiqi/CHIP/out?-t 6?/Users/xusiqi/CHIP/out/SRR2242690_1_trimmed.fq.gz
• fastqc -o?輸出絕對路徑?-t 線程數 輸入文件絕對路徑
• -o?后面為文件輸出絕對路徑，-t 6(為線程數)，?最后為輸入文件絕對路徑；大約 5min/file

5.bowtie2比對(15min/file)

bowtie2 -p 35 -x /Users/xusiqi/CHIP/index/hg19/hg19 -U? /Users/xusiqi/CHIP/lesson23/out/input.h3k.con_1_trimmed.fq.gz? -S input.h3k.con.sam bowtie2 -p 35 -x /Users/xusiqi/CHIP/index/hg19/hg19 -U? /Users/xusiqi/CHIP/lesson23/out/input.h3k.xy_1_trimmed.fq.gz? -S input.h3k.xy.sam bowtie2 -p 35 -x /Users/xusiqi/CHIP/index/hg19/hg19 -U? /Users/xusiqi/CHIP/lesson23/out/ip.h3k.con_1_trimmed.fq.gz? -S ip.h3k.con.sam bowtie2 -p 35 -x /Users/xusiqi/CHIP/index/hg19/hg19 -U? /Users/xusiqi/CHIP/lesson23/out/ip.h3k.xy_1_trimmed.fq.gz? -S ip.h3k.xy.sam

6.samtools sam?轉換?bam

6.1view &sort

samtools view -S -b input.h3k.con.sam > input.h3k.con.bam samtools sort input.h3k.con.bam -o input.h3k.con.sorted.bamsamtools view -S -b input.h3k.xy.sam > input.h3k.xy.bam samtools sort input.h3k.xy.bam -o input.h3k.xy.sorted.bamsamtools view -S -b ip.h3k.con.sam >ip.h3k.con.bam samtools sort ip.h3k.con.bam -o ip.h3k.con.sorted.bamsamtools view -S -b ip.h3k.xy.sam > ip.h3k.xy.bam samtools sort ip.h3k.xy.bam -o ip.h3k.xy.sorted.bam

6.2 index

samtools index input.h3k.con.sorted.bam samtools index input.h3k.xy.sorted.bam samtools index ip.h3k.con.sorted.bam samtools index? ip.h3k.xy.sorted.bam

7.bamCoverage?BW轉換 bam 轉換成 bw

bamCoverage -e 170 -bs 10 -p 35 -b input.h3k.con.sorted.bam -o input.h3k.con.sorted.bw bamCoverage -e 170 -bs 10 -p 35 -b input.h3k.xy.sorted.bam -o input.h3k.xy.sorted.bw bamCoverage -e 170 -bs 10 -p 35 -b ip.h3k.con.sorted.bam -o ip.h3k.con.sorted.bw bamCoverage -e 170 -bs 10 -p 35 -b ip.h3k.xy.sorted.bam -o ip.h3k.xy.sorted.bw

8.IGV查看 bw文件 peak

• IGV?下載?Downloads | Integrative Genomics Viewer
  • IGV?打開?bw?文件

9.MACS2 callpeak

• macs2 callpeak -t?實驗?sorted.bam?-c???對照inputsorted.bam?-g hs -B -f BAM -n?輸出名稱（無后綴，簡單命名）?-q 0.05 macs2 callpeak -t ip.h3k.con.sorted.bam -c? ?input.h3k.con.sorted.bam -g hs -B -f BAM -n con? -q 0.05 macs2 callpeak -t ip.h3k.xy.sorted.bam -c? ?input.h3k.xy.sorted.bam -g hs -B -f BAM -n xy -q 0.05

10.MACS2 差異分析（2021-10-15 待完善）

參考教程：

Call differential binding events · macs3-project/MACS Wiki · GitHub

需要的文件名 input.h3k.con.sorted.bam input.h3k.xy.sorted.bam? ip.h3k.con.sorted.bam??? ip.h3k.xy.sorted.bam con_control_lambda.bdg xy_control_lambda.bdg con_treat_pileup.bdg?? ?xy_treat_pileup.bdg	d-length?	tags after filtering
macs2 predictd -i input.h3k.con.sorted.bam macs2 predictd -i input.h3k.xy.sorted.bam macs2 predictd -i ip.h3k.con.sorted.bam macs2 predictd -i??ip.h3k.xy.sorted.bam	199 205	13313222 24184450 22342330 21410271
	202	callpeak excle?表中就有

11.Homer 分析 motif

公眾號參考?HOMER | chipseq數據進行peaks的差異分析

11.1查看所有的?list:

perl configureHomer.pl -list

11.2下載注釋信息

perl configureHomer.pl -install hg19 #（安裝hg19的GENOMES,會自動下載human數據，1.38G，多試幾次，網速可達 6-7Mb)

11.3 Create a tag directory

• homer?下新建一個?out?文件夾，在此路徑下運行以下代碼

  makeTagDirectory?文件夾名（tag directory）??-genome?hg19(帶絕對路徑)??-checkGC??輸入文件 sam（絕對路徑）

• 輸入文件名：input.h3k.con.sam?input.h3k.xy.sam??ip.h3k.con.sam????ip.h3k.xy.sam
• makeTagDirectory? input.h3k.con ?-genome /Users/xusiqi/chip/homer/data/genomes/hg19 -checkGC /Users/xusiqi/chip/lesson23/out/input.h3k.con.sam makeTagDirectory input.h3k.xy ?-genome /Users/xusiqi/chip/homer/data/genomes/hg19 -checkGC /Users/xusiqi/chip/lesson23/out/input.h3k.xy.sam makeTagDirectory? ip.h3k.con ?-genome /Users/xusiqi/chip/homer/data/genomes/hg19 -checkGC /Users/xusiqi/chip/lesson23/out/ip.h3k.con.sam makeTagDirectory? ip.h3k.xy ?-genome /Users/xusiqi/chip/homer/data/genomes/hg19 -checkGC /Users/xusiqi/chip/lesson23/out/ip.h3k.xy.sam

11.4 Differentially Bound Peaks（找差異peak）

getDifferentialPeaks <peak file> <target tag directory> <background tag directory> [options]

輸入文件名：

con_peaks.narrowPeak ?xy_peaks.narrowPeak
input.h3k.con ? input.h3k.xy ? ?ip.h3k.con ? ? ip.h3k.xy

getDifferentialPeaks /Users/xusiqi/chip/lesson23/out/con_peaks.narrowPeak ip.h3k.con/ input.h3k.con/ > con.diffpeaks.csv getDifferentialPeaks /Users/xusiqi/chip/lesson23/out/xy_peaks.narrowPeak ip.h3k.xy/ input.h3k.xy/ > xy.diffpeaks.csv

11.5?Annotate peaks（Peak注釋）

Usage:?annotatePeaks.pl?<peak?file?|?tss>?<genome?version>??[additional?options...]

輸入文件名：con.diffpeaks.csv ? ?xy.diffpeaks.csv

annotatePeaks.pl con.diffpeaks.csv /Users/xusiqi/chip/homer/data/genomes/hg19 > con.diffpeaks.anno.txt annotatePeaks.pl xy.diffpeaks.csv /Users/xusiqi/chip/homer/data/genomes/hg19 > xy.diffpeaks.anno.txt

用 R 把差異peak 和 Peak 注釋合并：fread,merge 函數

11.6 其他功能

• annotatePeaks.pl程序還可以用于創建顯示相對于給定基因組特征(包括轉錄起始位點(TSS)或用戶想要定義的任何其他區域)的相對讀富集的直方圖。由于TSS經常用于此目的，所以HOMER為TSS提供了一個內置注釋(基于RefSeq轉錄本)。創建直方圖的關鍵參數是“-hist #”和“-size #”選項，它們控制直方圖的裝箱大小和總長度。另一個重要的選項是“-d”，它指定要為哪些實驗編譯直方圖。
  • annotatePeaks.pl tss hg19 -size 8000 -hist 10 -d h3k.con/ h3k.bay/ > output.txt
  • 用電子表格程序/Excel打開output.txt文件。將注意到第一列給出了到TSS的距離偏移量，然后是對應于每個實驗的“覆蓋率”、“+標記”和“-標記”的列。嘗試用第一列作為X-Y線形圖來查看模式。

12. ROSE 尋找超級增強子 SE（super enhancer）

12.1 參考教程：?ROSE | 超級增強子鑒定

12.2 ROSE 安裝見上

12.3 ROSE 尋找 SE

? python ROSE_main.py -g HG19 -i xy_summits.bed -r ip.h3k.xy.sorted.bam -c input.h3k.xy.sorted.bam -o /Users/xusiqi/chip/rose/xy python ROSE_main.py -g HG19 -i con_summits.bed -r ip.h3k.con.sorted.bam -c input.h3k.con.sorted.bam -o /Users/xusiqi/chip/rose/con

（未完待續）

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總結

以上是生活随笔為你收集整理的Chip-seq分析笔记的全部內容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問題。

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