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ENCODE (Encyclopedia of DNA Elements) 作為DNA調控元件百科全書整合了1w+個來自不同組織或細胞系的各類實驗數據標準。以表觀組學研究中的ChIP-seq為例，ENCODE Consortium使用不同的表觀基因組分析，并制定對應的分析方案和指南，具有絕對的權威和參考意義。

本期，易基因小編為大家說明ENCODE數據庫的組蛋白ChIP-seq和轉錄因子ChIP-seq指標要求，包括測序分析概述、處理流程（Pipeline）指南和不同分析類型的數據標準。

組蛋白 ChIP-seq 數據標準和處理流程

（1）分析概述

ChIP-seq是一種用于分析蛋白質與DNA互作的方法。ChIP-seq將染色質免疫沉淀與DNA高通量測序相結合，以推斷DNA相關蛋白的可能結合位點。ENCODE Consortium開發了兩個分析pipeline來研究兩種不同類別的蛋白質-染色質互作（組蛋白ChIP-seq和轉錄因子ChIP-seq）。組蛋白ChIP-seq的pipeline適用于與較長區域或結構域上的DNA相關蛋白質。典型的靶點是組蛋白或特定的翻譯后組蛋白修飾。

（2）處理流程

組蛋白ChIP-seq和轉錄因子ChIP-seq的流程具有相同的比對步驟，但在信號和peak calling方法以及隨后的重復樣本統計處理方面有所不同。

組蛋白分析流程可以解析點狀結合和更長的染色質結構域，這些結構域由許多靶蛋白或靶修飾實例結合。組蛋白ChIP-seq 流程的output適合作為將染色質區域分類為功能類別的染色質分割模型的input。

圖1：具有生物學重復實驗的組蛋白ChIP-seq分析流程

圖2：沒有生物學重復實驗的組蛋白ChIP-seq分析流程

表1：組蛋白ChIP-seq分析流程的inputs

表2：組蛋白ChIP-seq分析流程的outputs

（3）流程指南

• 讀長應至少為50個堿基對，鼓勵更長的讀長；分析流程可以處理低至25個堿基對的讀長。可以配對或單端測序。
• 應注明使用的測序平臺。不同的測序平臺可能沒有可比性。如HiSeq2000與HiSeq4000的重復不同，沒有可比性。
• 生物學重復應在讀長和運行類型方面相匹配。
• Pipeline文件比對到人（GRCh38）和鼠（mm10）序列。

（4）現行標準

• 實驗應該有兩個或多個生物學重復。由于實驗材料的可用性有限，使用EN-TEx樣品進行分析可以例外。
• 抗體必須根據ENCODE Consortium制定的標準進行鑒定。
• 每個ChIP-seq實驗應該有相應的input控制實驗，具有匹配的運行類型，讀長和重復結構。
• 使用非冗余分數（NRF）和PCR瓶頸系數1和2，PBC1和PBC2衡量文庫復雜性。優選值如下：NRF>0.9，PBC1>0.9，PBC2>10。

特定目標標準

• narrow-peak組蛋白實驗，每個重復應該有不低于20M可用片段。
• broad-peak組蛋白實驗，每個重復應該有不低于45M可用片段。
• H3K9me3是一個例外，因為它在基因組重復區域富集。與其他broad Marks相比，在組織和原代細胞中基因組的非重復區域中幾乎沒有H3K9me3 peaks。導致許多ChIP-seq reads比對到基因組中的非唯一位置。組織和原代細胞每個重復應該有不低于45M總比對 reads。

圖3：特定目標標準

轉錄因子ChIP-seq 數據標準和處理流程

（1）分析概述

轉錄因子ChIP-seq (TF ChIP-seq) 處理流程適用于預測以點狀方式結合的蛋白質，例如特定 DNA 序列或特定染色質結構。其中，IP標靶通常是已知或推定的轉錄因子或染色質重塑蛋白，也可以是 RNA 結合蛋白、其他 DNA 或染色質特異性因子。

（2）處理流程

組蛋白ChIP-seq和轉錄因子ChIP-seq的流程具有相同的比對步驟，但在信號和peak calling方法以及隨后的重復統計處理方面有所不同。轉錄因子ChIP-seq（TF ChIP-seq）專門研究被認為與特定DNA序列相關聯以影響轉錄速率的蛋白質。

圖4：具有生物學重復實驗的轉錄因子ChIP-seq分析流程

圖5：沒有生物學重復實驗的轉錄因子ChIP-seq分析流程

表3：轉錄因子ChIP-seq分析流程的inputs

表4：轉錄因子ChIP-seq分析流程的outputs

（3）流程指南

• 讀長應至少為50個堿基對，鼓勵更長的讀長；分析流程可以處理低至25個堿基對的讀長。可以配對或單端測序。
• 應注明使用的測序平臺。不同的測序平臺可能沒有可比性。如HiSeq2000與HiSeq4000的重復不同，沒有可比性。
• 重復應在讀長和運行類型方面相匹配。
• Pipeline文件比對到人（GRCh38）和鼠（mm10）序列。

（4）現行標準

• 實驗應該有兩個或多個生物學重復。由于實驗材料的可用性有限，使用EN-TEx樣品進行分析可以例外。
• 抗體必須根據ENCODE Consortium制定的標準進行鑒定。
• 每個ChIP-seq實驗應該有相應的input控制實驗，具有匹配的運行類型，讀長和重復結構。
• 使用非冗余分數（NRF）和PCR瓶頸系數1和2，PBC1和PBC2衡量文庫復雜性。優選值如下：NRF>0.9，PBC1>0.9，PBC2>10。

特定目標標準

• 每個重復應該有不低于20M可用片段。
  • 低reads深度：10M到20M可用片段
  • reads深度不足：5M到10M可用片段
  • 極低的reads深度：< 5M可用片段

• 對于轉錄因子ChIP-seq實驗，通過計算IDR值（Irreproducibility Discovery Rate）來檢測生物學重復之間的重復性。如果rescue和self consistency ratio均小于2，則實驗成功。

其他指標

在沒有定義閾值的情況下計算額外的指標，例如FRiP（fraction of reads in peaks），在比較類似實驗時很有用。

以上為ENCODE數據庫中組蛋白ChIP-seq和轉錄因子ChIP-seq數據標準及處理流程是簡要說明。

參考來源：https://www.encodeproject.org/data-standards/

手把手教你做染色質免疫共沉淀測序(ChIP-seq)分析實驗

項目文章 | ChIP-seq揭示HIV-1感染細胞轉錄抑制因子Schlafen 5的表觀遺傳調控機制

項目文章｜ChIP-seq揭示H3K27me3去甲基化酶在體細胞重編程調控轉錄機制

一文看懂：ChIP實驗和qPCR定量分析怎么做

ENCODE組蛋白ChIP-seq和轉錄因子ChIP-seq數據標準及處理流程https://link.zhihu.com/?target=https%3A//mp.weixin.qq.com/s%3F__biz%3DMzAwNTY3NDIxMw%3D%3D%26mid%3D2650651226%26idx%3D1%26sn%3D82d0baa66a6f2d2b67c7c6dcac64dae9%26chksm%3D83101fd0b46796c6bbb4d19cee2e0f5f72532880f6d082ba006fd90b37940d7856979fd73304%26token%3D378077105%26lang%3Dzh_CN%2522%2520%255Cl%2520%2522rd

http://www.egenetech.com

總結

以上是生活随笔為你收集整理的易基因｜ENCODE组蛋白ChIP-seq和转录因子ChIP-seq数据标准及处理流程的全部內容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問題。

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