从零开始学PCR技术（五）：试验污染
PCR 反應最大的特點是具有較大的擴增能力和極高的靈敏度，正因為如此，極其微量的污染即可造成檢測結果的假陽性。監控污染，防止污染對檢測結果的影響，不僅對實驗，對后續生信分析也提出了挑戰。
一、污染原因
1. 交叉污染
(1) 容器被污染。
(2) 標本放置時，由于密封不嚴溢于容器外。
(3) 容器外粘有標本而造成相互間交叉污染。
(4) 標本核酸模板在提取過程中，由于吸樣槍污染導致標本間污染。
(5) 有些微生物標本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴散，導致彼此間的污染。
2. 試劑污染
PCR 試劑配制過程中，由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被 PCR 核酸模板污染。
3. 擴增產物污染
這是 PCR 污染最主要的形式，因為：
(1) PCR 產物拷貝量大（一般為 10^13 拷貝/ml），遠遠高于 PCR 檢測數個拷貝的極限，所以極微量的 PCR 產物污染，就可形成假陽性。
(2) 最有可能造成 PCR 產物污染的形式是氣溶膠污染。在空氣與液體面摩擦時就可形成氣溶膠，在操作時比較劇烈地搖動反應管，開蓋時、吸樣時及污染進樣槍的反復吸樣都可形成氣溶膠而污染。據計算一個氣溶膠顆粒可含 48000 拷貝，因而由其造成的污染是一個值得特別重視的問題。
4. 克隆質粒污染
(1) 某些用克隆質粒做陽性對照的檢驗室，這個問題比較常見。
(2) 克隆質粒在單位容積內含量相當高，另外在純化過程中需用較多的用具及試劑，而且在活細胞內的質粒，由于活細胞的生長繁殖的簡便性及具有很強的生命力，其污染可能性也很大。
二、污染監測
通常使用對照對檢測的各個環節進行監控，常用的對照有以下這些。
(一) PCR 中的對照
1. 陽性對照與陰性對照
陽性對照和陰性對照是指在相同的處理條件下，比如一份已知的感染樣品和一份已知的未感染樣品，都進行了提取和擴增最終獲得了陽性結果和陰性結果。陰陽性對照強調處理過程與樣品一致，并且有明確的預期結果。
2. 擴增對照
我們通常說的陽性對照和陰性對照指的是擴增試劑盒中附帶的不需要提取的陽性對照和陰性對照，更準確的定義應該是擴增陽性對照和擴增陰性對照。擴增陽性對照含有陽性擴增模板，擴增陰性對照應含有陰性擴增模板（基質核酸）。擴增對照只能監控每次擴增過程中的擴增系統是否正常，不能監控采樣、提取和每份樣品的操作過程。如果是檢測 RNA 樣品的檢測試劑盒，其擴增陽性對照使用質粒，便無法監控反轉錄過程。
3. 內標（Internal Control, IC）
內標是指在同一反應管中與靶序列共同擴增的一段非靶序列分子。內標有兩種形式，一種是使用天然樣品中含有的內參基因作為內標，另一種是人工添加的內標。內標的最大特點是與靶序列共同擴增，而其他的對照都是獨立擴增。
(1) 內參基因
通常它們在各組織和細胞中的表達相對恒定，在檢測基因的表達水平變化時常用它來做參照物。內參基因通常是管家基因（house-keeping gene）因為其表達水平受環境因素影響較小，而且在個體各個生長階段的幾乎全部組織中持續表達變化很小。常用的內參基因包括 GAPDH、β-actin (BETA-actin)、18sRNA、B2M、HPRT 和 TBP 等。
內參基因的優點是與樣品中的靶基因經歷完全相同的處理程序，可以監控采樣，運輸，核酸提取和擴增的全部過程。缺點是不同物種，不同生理狀態下，不同組織中的內參基因存在一定的差異。如果樣品類型是口腔液，咽拭子等樣品，內參基因的量很低可能導致實驗不成功。如果檢測的是環境樣品則內參基因可能完全失效。
(2) 人工內標
添加一種不會干擾靶序列擴增的人工合成的內標。現在國外的診斷試劑盒大部分都會將內標直接添加在反應液中與模板一起擴增，但是這樣的內標不能監控采樣，運輸和核酸提取的過程。
還有另一種形式的內標，使用人工合成的假病毒，在核酸提取前在每一份樣品中加入等量的內標，這樣就可以監控樣品的提取到擴增的過程。但是由于是人工添加到樣品中，仍然不能監控胞內細菌病毒的釋放情況。
4. 核酸提取對照
可以使用內參基因，假病毒混合基質，滅活病毒混合基質來監控提取到擴增的流程。
5. 反轉錄對照（RT control）
可以使用提取好的 RNA 內參基因，RNA 假病毒混合基質，滅活 RNA 病毒混合基質來監控反轉錄到擴增的流程。
無反轉錄對照（no-RT control）含有除反轉錄酶以外的所有成分。
6. 空白對照
(1) 無模板空白對照
NTC （No Template Control）是指不含有模板（陽性模板或者陰性模板），但含有引物探針和反應液，主要監控引物探針、反應體系有沒有被污染的對照。目前的試劑盒的 NC 一般都是水或陰性緩沖液，所以 NC 等同于 NTC。其實兩者有不同的作用。
(2) 儀器空白對照
儀器空白對照通常使用的是空反應管來監控儀器有無非特異性的熒光信號。
(3) 熒光染料對照
最常使用的是 ROX 染料，由于熒光定量 PCR 的熒光信號在每個樣品孔會有微小的差異所以使用特定的 ROX 熒光染料，系統可以根據 ROX 熒光染料的信號值來校準每孔的熒光信號。
7. 質控品（Quality control, QC）
上述環節中使用的各種對照大部分是試劑廠家匹配試劑盒使用的產品，有的是實驗室自制，所以整個的監控過程可能存在不夠客觀和獨立。因此在實驗室的對照設置中每次檢測都建議使用第三方質控品，有條件的使用國家有證標準物質 (Reference material ,RM)。由于標準物質具有準確量值和計量溯源性，可以更準確的評估整個試驗流程的準確度。
8. 定值參考品
醫學上的定量檢測試劑盒，需要配套定值參考品用于試劑盒的定量檢測使用。
(二) PCR 對照的選擇
從上文可知沒有一種對照是完美的，在檢測中我們要根據自己的需求來進行靈活選擇和搭配。筆者建議每一次檢測時添加一個能對從提取到擴增環節進行監控的質控品或標準物質；每份檢測樣品中添加內標（如果樣品種類比較多樣建議使用人工內標，如果樣品類型為相對固定的動物組織建議使用內參基因）；擴增陽性對照，擴增陰性對照，無模板對照和 ROX 對照。有條件的添加臨床陽性對照和臨床陰性對照，在懷疑提取環節或者反轉錄環節出現問題時使用核酸提取對照和反轉錄對照。不定期使用儀器空白對照。
1. 陽性對照與污染
不可否認的一個事實是陽性對照可以增加實驗室污染的風險。這種污染的來源一種是直接來源于擴增陽性對照的污染。對于擴增陽性對照來說通常 10000 拷貝 / 微升（CT 值約 25）是比較理想的，但是有一些試劑盒廠家的擴增陽性對照設置在 CT 值 20 以下，比大部分陽性樣本都強。這么高濃度的對照給實驗室帶來了巨大的污染風險，原因可能僅僅是因為試劑廠家擔心其陽性對照不穩定，長時間存放陽性對照降解。另一種污染來自于擴增產物的處理不當，或者實驗室的設計布局不合理。
2. 初篩和確診
對于初篩實驗，我們希望提高真陽性檢出率，即提高診斷敏感性。我們需要檢測系統達到最高檢測效率，因此要在不同環節添加陽性對照，確保每個環節的檢測效率最高。
對于確診實驗，我們希望提高真陰性檢出率，即提高診斷特異性。我們需要確保檢測系統不出現假陽性，因此要在不同環節添加陰性對照，減少非必須的陽性對照，甚至要在樣品盤的不同位置中隨機插入幾個陰性對照，確保實驗過程中沒有被污染。
三、污染預防
1. 首要原則
(1) 永遠要設置 NTC 對照：如果不能在污染出現的第一時間發現，會導致嚴重后果：一大段時間的數據不可信。
(2) 準備 PCR 的移液器要專用：千萬不能用吸取 PCR 產物/克隆質粒的移液器去準備 PCR 體系。
2. 基本策略
2.1 劃分操作區
目前，普通 PCR 尚不能做到單人單管，實現完全閉管操作，但無論是否能夠達到單人單管，均要求實驗操作在三個不同的區域內進行，PCR 的前處理和后處理要在不同的隔離區內進行。
(1) 標本處理區，包括擴增摸板的制備。
(2) 擴增區，包括反應液的配制和 PCR 擴增。
(3) 產物分析區，凝膠電泳分析，產物拍照及重組克隆的制備。
(4) 各工作區要有一定的隔離，操作器材專用，要有一定的方向性。如：標本制備 →PCR 擴增 → 產物分析 → 產物處理。
切記：產物分析區的產物及器材不要拿到其他兩個工作區。
2.2 分裝試劑
PCR 擴增所需要的試劑均應在裝有紫外燈的超凈工作臺或負壓工作臺配制和分裝。所有的加樣器和吸頭需固定放于其中，不能用來吸取擴增后的 DNA 和其他來源的 DNA。
(1) PCR 用水應為高壓的雙蒸水。
(2) 引物和 dNTP 用高壓的雙蒸水在無 PCR 擴增產物區配制。
(3) 引物和 dNTP 應分裝儲存，分裝時應標明時間，以備發生污染時查找原因。
2.3 實驗操作注意事項
盡管擴增序列的殘留污染大部分是假陽性反應的原因，樣品間的交叉污染也是原因之一。因此，不僅要在進行擴增反應時謹慎認真，在樣品的收集、抽提和擴增的所有環節都應該注意。
(1) 戴一次性手套，若不小心濺上反應液，立即更換手套。
(2) 使用一次性吸頭，嚴禁與 PCR 產物分析室的吸頭混用，吸頭不要長時間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染。
(3) 避免反應液飛濺，打開反應管時為避免此種情況，開蓋前稍離心收集液體于管底。若不小心濺到手套或桌面上，應立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面。
(4) 操作多份樣品時，制備反應混合液，先將 dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然后分裝，這樣即可以減少操作，避免污染，又可以增加反應的精確度。
(5) 最后加入反應模板，加入后蓋緊反應管。
(6) 操作時設立陰陽性對照和空白對照，既可驗證 PCR 反應的可靠性，又可以協助判斷擴增系統的可信性。
(7) 盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器，由于加樣器最容易受產物氣溶膠或標本 DNA 的污染，最好使用可替換或高壓處理的加樣器。如沒有這種特殊的加樣器，至少 PCR 操作過程中加樣器應該專用，不能交叉使用，尤其是 PCR 產物分析所用加樣器不能拿到其它兩個區。
(8) 重復實驗，驗證結果，慎下結論。
注：本文內容來源于網絡，僅供自己學習參考之用。
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總結
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