剛接觸高通量測序的時候就知道有鏈特異性建庫這么個概念，當(dāng)時也了解可以利用加U法，但是沒有思考其中的細(xì)節(jié)。最近把這個概念掰開了揉碎了好好理解，終于填上了這個坑。

正式講之前，有幾個概念是要明確的。

DNA 的正鏈和負(fù)鏈，就是那兩條反向互補(bǔ)的鏈。參考基因組給出的那個鏈就是所謂的正鏈（forword），另一條鏈?zhǔn)欠存?#xff08;reverse）。但是這正反一定不能和正義鏈（sense strand）反義鏈（antisense strand）混淆。

正義鏈（sense strand）：兩條互補(bǔ)的DNA鏈其中一條攜帶編碼蛋白質(zhì)信息的鏈稱為正義鏈，又稱編碼鏈，因為它的序列與mRNA相同。

反義鏈（antisense strand）：另一條與之互補(bǔ)的稱為反義鏈。而反義鏈雖然和RNA反向互補(bǔ)，但它可是真正給RNA當(dāng)模板的鏈，因此反義鏈也是模板鏈。

要注意的是：在一條包含有若干基因的雙鏈DNA分子中，各個基因的正義鏈并不都是在同一條鏈上。

也就是說，有的基因的正義鏈?zhǔn)钦?#xff08;forword strand），有的基因的正義鏈?zhǔn)欠存?#xff08;reverse strand）。所以，DNA雙鏈中的一條鏈對某些基因來說是正義鏈，對另一些基因來說則是反義鏈

總結(jié)兩點

正義鏈（sense strand）= 編碼鏈（coding strand）= 非模板鏈

forword strand 上可以同時有sense strand 和 antisense strand。因為這完全是兩個不同的概念

下面通過這張建庫示意圖來看看普通RNA-Seq建庫和鏈特異性建庫的差異在什么地方

首先說說普通的RNA-Seq建庫方式：它是在RNA逆轉(zhuǎn)錄成雙鏈cDNA的兩端，對稱地加上了兩個Y型的接頭，然后變成文庫。它有一個缺點，就是它是以雙鏈DNA進(jìn)行測序。所以測完序后，我們無法知道測出來的reads是來自正鏈還是負(fù)鏈。

而鏈特異性建庫（以圖中間的dUTP方法為例）則是首先利用隨機(jī)引物合成RNA的一條cDNA鏈，在合成第二條鏈的時候用dUTP代替dTTP，加adaptor后用UDGase處理，將有U的第二條cDNA降解掉。降解發(fā)生之后，雙鏈的文庫就只剩下了一條鏈（負(fù)鏈）。而這條鏈的兩頭是接的不同序列的接頭。通過PCR擴(kuò)增，最終只保留了第一條cDNA（負(fù)鏈）上級測序。這樣最后的insert DNA fragment都是來自于第一條cDNA（負(fù)鏈），也就是dUTP叫fr-firststrand的原因。在測序的過程中先測得正鏈reads，再測得負(fù)鏈reads（能區(qū)分正負(fù)鏈reads，這就是和普通建庫最根本的不同）。在這些reads比對到參考基因組時，那些比對到基因方向（正義鏈方向）的正鏈reads就是正義鏈reads，但是那些比對到基因方向反方向（反義鏈方向）的正鏈reads就是反義鏈reads。那么同樣，比對到基因方向的負(fù)鏈reads就是正義鏈reads，而比對到基因方向反方向（反義鏈方向）的負(fù)鏈reads就是反義鏈reads。從而最終將所有正義鏈reads和反義鏈reads區(qū)分開來。因此在確定基因表達(dá)水平時，可以避免基因反義鏈上的reads匹配的干擾，從而更加準(zhǔn)確的檢測基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。而且LncRNA的測序也離不開鏈特異性建庫技術(shù)。原因有三：

1）lncRNA的來源是具有鏈特異性的；

2）lncRNA來源就是編碼蛋白（mRNA）?基因的反義鏈，是傳說中的天然反義lncRNA（NAT-antisense lncRNA）；如果是普通非鏈特異性建庫，那么序列是來自mRNA，還是NAT-antisence LncRNA就難以區(qū)分了；

3）?鏈特異性建庫可更準(zhǔn)確地統(tǒng)計轉(zhuǎn)錄本的數(shù)量和確定基因的結(jié)構(gòu)，準(zhǔn)確區(qū)分獲得的轉(zhuǎn)錄本來自基因組哪條鏈。?

總結(jié)

以上是生活随笔為你收集整理的对链特异性建库的理解的全部內(nèi)容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問題。

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