RNA-seq連特異性

Oct 15, 2015

The strandness of RNA-seq analysis

前段時間一直在研究關于illumina TrueSeq stranded RNA-seq中的strand如何判斷的問題。之后我又查了很多資料，終于弄懂了。現在寫下來,如果我有錯誤，歡迎繼續指正。 以下文字和圖片的引用鏈接都已經給出，如果圖片在郵件中無法顯示，可以打開鏈接的。

先說結論：對于Illumina TrueSeq stranded RNA protocol，主要采用的是dUTP method。RNA的strand是與read1（先測的read）相反，與read2（后測的read）的strand相同的。換句話說，如果read1比對到基因組正鏈上，則對應的RNA是在基因組的負鏈上。如果read2比對到基因組正鏈上，則對應的RNA應該是比對到正鏈上。

具體解釋如下：

1.關于strand：

1）DNA是由兩條互補配對的鏈組成的。按照預定俗稱，把其中一條鏈稱為正鏈（plus strand or forward strand），另一條則是負鏈（minus strand or reverse strand），這個定義完全是人為的。我們下載的hg18、hg19、hg38的fasta格式只給出了正鏈的序列。另一條鏈可以根據互補配對得出。

2）我們讀取的鏈的時候，經常是從5’到3’的，無論DNA還是RNA。測序出來的兩個read，也都是從5’到3’的。視覺上，我們讀取plus strand的時候，from left to right。讀取minus strand的時候，from right to left。

3）RNA會根據一條DNA模板合成，我們在IGV或者UCSC上會看到RNA的鏈的信息，如果一條RNA在正鏈上（如下圖），其實該條RNA是以負鏈作為模板形成的，但是該條RNA與正鏈的序列一直。我們把和合成RNA時的DNA模板的鏈稱為template strand或者antisense strand。把與RNA序列相同的DNA的鏈稱為coding strand或者sense strand。sense/antisense, coding/template strand可以在基因組的plus strand也可以在基因組的minus strand。

http://www.majordifferences.com/2015/01/difference-between-sense-and-antisense.html

2、illumina測序之sample preparation：

1）illumina測序的sample preparation的步驟，一般是講DNA或者是cDNA打斷，然后repair ends，add A at 3’end （為了和Y-shaped adaptor結合），然后加上adaptor。

2）adaptor也是由兩條鏈組成的（universal adaptor和indexed adaptor）。unversal adaptor的3’端有一個T，為了可以和DNA fragment上的A互補。universal adaptor的3’端和indexed adaptor的5’端有12bp的堿基互補配對，使得他們兩個可以呈現Y字形。indexed adaptor的中間有6個bp的indexed sequence，可以用來在同一個land中有多個樣本時做區分。

3）若是非連特異性的，對于最后合成的sample，中間的DNA fragment既可以來自正鏈，也可以來自負鏈。

http://onetipperday.blogspot.com/2013/06/illumina-hiseq2000-adaptor.html

3、dUTP method的sample preparation：

dUTP metod主要是在反轉完first-strand cDNA之后，在合成second-strand cDNA的時候，用dUTP代替了dTTP，之后加完adaptor，用UDGase處理，將second-strand cDNA消化掉。這樣最后合成的sample，中間的DNA fragment一定是first-strand cDNA。這也是為什么對于dUTP數據處理，tophat的參數應該為“–library-type fr-firststrand”。注意，這里的first-strand cDNA與RNA strand（或者基因組上的coding strand）相反。

http://onetipperday.blogspot.com/2013/06/illumina-hiseq2000-adaptor.html

4、illumina測序之cluster generation和sequencing

1）sample preparation之后，樣品就上機測序了。在flow cell的表面，固定著很多個DNA序列，他們有兩種P5和P7，均是5’在flow cell的表面，3’露在上面。

2）P5的序列與sample 5’端的unversial adapter 開始的44（數字可以不同）個bases相同，P7的是與sample的3’端的indexed adapter的24（數字可以不同）個bases互補配對。P5和P7同時可以充當與sample DNA序列雜交的探針還有PCR擴增的引物。

3）sample DNA上機后，首先與P7雜交，然后以P7為引物合成。如下圖，之后洗掉原來的sample DNA，然后P7上的DNA的3’端正好與P5雜交，建起bright，然后再以P5為引物合成。就這樣不斷amplification。

4）之后測序的時候，會先將P5進行Periodate linearization（具體不是很懂，應該就是把P5上的DNA弄走）。然后用引物來測定P7中間DNA fragment的序列，就是read1中的序列（注意，這里的引物與P5和P7不同，可以保證直接測出中間感興趣的序列。但是若中間DNA fragement太短，就會測到adaptor序列，這就是為什么fastq文件要做adaptor trimming）。如果是Pair-end序列。P7上的序列測完之后，再合成P5的DNA，然后再用另一種酶把P7弄走，去測P5的序列。這樣就保證測量了pair-end。從這個過程可以看到read1和read2一定是分布會比對到基因組不同的鏈上。

5）對于strand-specifc，由于sample DNA中間感興趣的DNA fragement只有first-strand。這個fragment先于P7雜交，然后合成second strand cDNA。然后測序的時候，read1是與P7上的second strand cDNA互補配對的。（first-strand cDNA <- rc -> P7上的second strand cDNA <-rc->read1的序列）。故read1與first-strand cDNA的鏈相同，與RNA的strand鏈相反。反之，read2與RNA strand的鏈相同。

http://onetipperday.blogspot.com/2013/12/illumina-hiseq2000-adaptor-and.html

http://skatebase.org/sites/skatebase.org/files/workshops/W1_IntroIlluminaNGS.pdf

5、tophat中output的bam文件中有一個tag XS是錯的

tophat輸出的bam文件的attribute tag中有一個XS是指示RNA所在的strand的。但是很多人都發現了錯誤。而且Encode還寫了一個perl腳本來修改XS tag。也有人說XS主要是根據splite site的序列判斷的。XS: “+” for GT-AG and “-“ for CT-AC。另外，因為cufflinks是需要XS的這個tag的，所以這個問題還需要再研究一下。

6、可以通過sam文件的第2列的flag來判斷read的strand

sam flag可以指示該條read是read1（first in pair）還是read2（second in pair），或者比對到正鏈上（mate reverse strand）還是負鏈上（read reverse strand）。 我其實也不懂得flag這個16進制，這有個網址給了一個簡單的軟件，可以幫助計算。然后用samtools view -f或者-F就可以根據flag來篩選了。

7、參考資料：

http://onetipperday.blogspot.com/2013/06/illumina-hiseq2000-adaptor.html

http://onetipperday.blogspot.com/2012/07/how-to-tell-which-library-type-to-use.html

http://onetipperday.blogspot.com/2013/12/illumina-hiseq2000-adaptor-and.html

http://www.personal.psu.edu/iua1/courses/illumina-sequencing.html

http://skatebase.org/sites/skatebase.org/files/workshops/W1_IntroIlluminaNGS.pdf

http://seqanswers.com/forums/showthread.php?t=9303

轉載于:https://www.cnblogs.com/wangprince2017/p/9809223.html

總結

以上是生活随笔為你收集整理的RNA-seq连特异性的全部內容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問題。

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