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題目：The red flesh of kiwifruit is differentially controlled by specific activation–repression systems

刊名：New Phytologist

作者：Wen-qiu Wang，Andrew C. Allan,Xue-ren Yin et al

單位：Zhejiang University

日期：29 March 2022?

01

摘要

花青素是授粉和種子傳播的視覺線索。含有花青素的水果也因其外觀和健康益處而吸引消費(fèi)者。在獼猴桃（獼猴桃屬）中，研究已經(jīng)確定了至少兩種花青素 MYB 激活劑，但它們?cè)谒械墓δ芤约八鼈兊淖饔脵C(jī)制尚不完全清楚。

在這里，轉(zhuǎn)錄組和小 RNA 高通量測(cè)序被用于全面鑒定獼猴桃中花青素積累的貢獻(xiàn)者。

在葡萄藤中穩(wěn)定的過表達(dá)表明，35S::MYB10和MYB110都可以上調(diào)獼猴桃果實(shí)中花青素的生物合成，并且MYB10的過表達(dá)導(dǎo)致花青素積累僅限于內(nèi)果皮，表明抑制機(jī)制是該物種花青素生物合成的基礎(chǔ)。此外，MYB10/110的 C 末端區(qū)域中的基序被證明與花青素反應(yīng)的激活強(qiáng)度有關(guān)。瞬時(shí)分析表明MYB10和MYB110 均不被 miRNA 直接切割，但 miR828 及其定相小 RNA AcTAS4-D4(-) 有效靶向MYB110。鑒定了在內(nèi)果皮和外果皮之間差異表達(dá)的其他miRNA，并觀察到SPL13、ARF16、SCL6和F-box1的切割，這些都是MYB10的阻遏物。

我們得出結(jié)論，是 MYB 激活劑的差異表達(dá)和隨后的抑制導(dǎo)致獼猴桃物種中花青素積累的變化。

02

技術(shù)路線

Hongyang’ (Actinidia chinensis) kiwifruit at colour change stage

Kiwifruit and Nicotiana benthamiana total RNA extraction

First-Strand cDNA synthesis and RT-qPCR (Real-Time Quantitative PCR)

High-throughput sequencing and analysis

Kiwifruit stable transformation

Genome synteny and collinearity Analysis

Isolation and cloning of candidate genes and MIRNAs

Transient over-expression in Nicotiana tabacum and Nicotiana benthamiana plants

Dual-luciferase assays

Anthocyanin extraction and quantification

Firefly luciferase complementation imaging assay (LCI)

03

主要結(jié)果

3.1 紅陽(yáng)獼猴桃花色素苷代謝關(guān)鍵基因的鑒定

授粉10周后，花青素在“紅陽(yáng)”果實(shí)的內(nèi)果皮中明顯積累（圖1a）。通過RNA高通量測(cè)序，以探索基于高質(zhì)量參考基因組（Red5）的關(guān)鍵基因。根據(jù)先前的研究總結(jié)了編碼生物合成酶的花青素相關(guān)基因（圖1b，補(bǔ)充表S6）。進(jìn)一步的分析表明，F3H1、F3H2、F3’5'H、F3GT1和GST1與發(fā)育系列和差異組織中花青素積累的視覺觀察結(jié)果呈正相關(guān)（圖1a，補(bǔ)充圖S1）。

我們根據(jù)共表達(dá)基因的表達(dá)模式（R≥0.6，圖1c），以及它們?cè)讷J猴桃基因組中的位置。從該分析中，我們發(fā)現(xiàn)279個(gè)基因與所有這五個(gè)花青素相關(guān)基因共表達(dá)（補(bǔ)充圖S2a，b；補(bǔ)充表S2）。這些基因在發(fā)育和空間上都受到調(diào)控，在內(nèi)果皮中高度表達(dá)，表明受轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

PlantTFDB（植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(kù)）用于分析279個(gè)基因，其中17個(gè)被預(yù)測(cè)為轉(zhuǎn)錄因子，包括NAC、AP2、MADS和MYB（補(bǔ)充圖S3a、b；補(bǔ)充表S2）。所有轉(zhuǎn)錄因子都被克隆，并在煙草葉中瞬時(shí)過表達(dá)。17種TF與花青素積累相關(guān)，但只有MYB10激活了煙草中的花青素水平。使用MYB110作為對(duì)照，其具有比MYB10更強(qiáng)的激活作用（補(bǔ)充圖S4）。然而，其他16種TF中沒有一種有助于MYB10活性（補(bǔ)充圖S5），事實(shí)上有三種是強(qiáng)阻遏物（Acc23145/HSFB3、Acc25983/C2H2-82和Acc29865/MYB223）。共表達(dá)分析的預(yù)測(cè)包括MYB10，實(shí)時(shí)定量PCR（RT-qPCR）證實(shí)了這一點(diǎn)，該P(yáng)CR顯示MYB110的轉(zhuǎn)錄水平在整個(gè)果實(shí)發(fā)育過程中在內(nèi)果皮中較高（圖1d）。因此，轉(zhuǎn)錄組和瞬時(shí)分析支持MYB10在“紅陽(yáng)”水果著色中的重要性。

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Fig. 1

3.2 獼猴桃中MYB10和MYB110的過度表達(dá)揭示了不同的功能

獼猴桃（品種A.chinensis cv.Hort16A）中35S:：MYB10和35S::MYB110的穩(wěn)定過表達(dá)增加了葉片中的花青素含量。盡管在“紅陽(yáng)”中未檢測(cè)到MYB110，但基于RNA seq或RT-qPCR（補(bǔ)充圖S6a，b），我們的結(jié)果表明，MYB10和MYB11在過度表達(dá)時(shí)，都會(huì)產(chǎn)生積累花青素的果實(shí)（圖2）。對(duì)照品系保留黃色果肉，類似于果園種植的“Hort16A”果實(shí)。

MYB10過表達(dá)植物的果實(shí)在內(nèi)部果皮中積累花青素（圖2），盡管MYB110由組成型35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。RT-qPCR用于比較外果皮和內(nèi)果皮之間的轉(zhuǎn)錄水平，這表明轉(zhuǎn)基因在整個(gè)果實(shí)中表達(dá)良好，但在內(nèi)果皮中表達(dá)稍高（補(bǔ)充圖S7）。因此，這些MYB10過度表達(dá)的水果現(xiàn)象復(fù)制了“紅陽(yáng)”水果的自然外觀。相比之下，MYB110過表達(dá)系在果肉和皮膚的所有區(qū)域都積累了花青素（圖2），這反映出了黑木耳和黑木耳的紅色肉質(zhì)選擇，其中MYB10已被觀察到表達(dá)。RT-qPCR顯示MYB110在外果皮和內(nèi)果皮中組成性表達(dá)（補(bǔ)充圖S7）。因此，MYB10和MYB110似乎足以激活獼猴桃屬植物的花青素。MYB10和MYB110在果實(shí)中過度表達(dá)時(shí)的表型表明，潛在的阻遏物控制花青素合成和最終外觀。

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Fig. 2

3.3 獼猴桃中MYB10和MYB110的進(jìn)化分析揭示了激活花青素生物合成的關(guān)鍵基序

系統(tǒng)發(fā)育分析表明，MYB10和MYB110是同源基因，它們與另一個(gè)MYB（Acc10227）聚集成一個(gè)亞組（補(bǔ)充圖S8）。Acc10227（MYB210）已在獼猴桃雜交種群中鑒定，與MYB110緊密相關(guān)。這些結(jié)果暗示了一種潛在的遺傳關(guān)系。MCscanX用于檢測(cè)獼猴桃基因組中是否存在共線性。有趣的是，分析顯示，在一個(gè)分別含有MYB10和MYB110/210的區(qū)域，Chr01:6720929-9462208和Chr09:5346916-7131334顯示了大規(guī)模連鎖（圖3a）。微合成圖顯示MYB110和MYB210位于Chr09:5346916-7131334上，緊密連接但不直接連接。分析表明MYB10和MYB210是直接共線的。此外，MYB110和MYB210更可能是近端重復(fù)的產(chǎn)物。MYB10和MYB110在不同的獼猴桃中表達(dá)，它們?cè)谶M(jìn)化過程中趨向于亞功能化（導(dǎo)致不同的紅色果實(shí)表型）；MYB210在花瓣、肉或其他組織中未檢測(cè)到，因此可能沒有功能。

對(duì)MYB10和MYB110蛋白序列的比較顯示了C末端區(qū)域的差異（圖3b）。MYB10和MYB110都含有一個(gè)非常相似的R2R3結(jié)構(gòu)域，以及一組C端殘基，分別稱為MYB11基序和MYB110基序（圖3b）。為了測(cè)試這些MYB10-或MYB110基序是否影響花青素誘導(dǎo)的效率，我們交換了基序或?qū)⑵鋸木幋a序列中刪除（圖3b）。瞬時(shí)分析表明，MYB110基序可以增加MYB10的花青素積累水平（MYB10C，圖3c，d），而攜帶MYB12基序的MYB11在花青素誘導(dǎo)方面表現(xiàn)出顯著損失（MYB110C，圖3c，d）。此外，當(dāng)C端基序缺失（MYB110D和MYB10D）時(shí)，滲透導(dǎo)致花青素誘導(dǎo)很少（圖3c，d）。因此，MYB10/110的C末端的基序被顯示為影響花青素產(chǎn)生的強(qiáng)度。

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Fig.3

3.4 “紅陽(yáng)”果實(shí)抑制性轉(zhuǎn)錄過程的鑒定

盡管MYB10在整個(gè)果實(shí)中都有表達(dá)，但過表達(dá)MYB110的果實(shí)的色素沉著模式與“紅陽(yáng)”果實(shí)表現(xiàn)出相似的外觀。這表明，由MYB10表達(dá)驅(qū)動(dòng)的花青素積累進(jìn)一步受到抑制機(jī)制的影響，這種抑制機(jī)制在外果皮中表現(xiàn)得更強(qiáng)。此外，MYB110在“紅陽(yáng)”果實(shí)中不表達(dá)。因此，分析了MYB10和MYB110的潛在阻遏物。

進(jìn)行小RNA測(cè)序以檢測(cè)“紅陽(yáng)”果肉中表達(dá)的miRNA。發(fā)現(xiàn)了近2800個(gè)具有潛在前體的成熟miRNA。主成分分析（PCA）表明，內(nèi)果皮和外果皮在PCA2維度上有區(qū)別（圖4a）。共表達(dá)分析顯示，授粉后10周和12周（WAP），當(dāng)比較外果皮和內(nèi)果皮中的miRNA水平時(shí)，15個(gè)miRNA上調(diào)，5個(gè)下調(diào)（圖4b，c；補(bǔ)充表S7）。然而，預(yù)測(cè)分析（使用psRobot軟件）表明，這些不同表達(dá)的miRNA不能直接切割MYB10或MYB110。發(fā)現(xiàn)MYB11和MYB12與AtMYB75（AtPAP1）和AtMYB90（PAP2）同源，已證明其受相iRNA AtTAS4-siR81（-）調(diào)控。

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Fig. 4

在小RNA測(cè)序數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)了一種類似于AtTAS4-siR81（-）的小RNA，具有四個(gè)核苷酸差異（補(bǔ)充圖S10a）。該推測(cè)的小RNA被預(yù)測(cè)與MYB110（補(bǔ)充圖S10b）有效結(jié)合，但與MYB1 0無效。推測(cè)的小RNA位于Chr05:14577221-14577201上，然后延伸300 bp至側(cè)翼區(qū)域，其中發(fā)現(xiàn)了miR828靶位點(diǎn)（圖5a）。在該區(qū)域發(fā)現(xiàn)了大量的小RNA，這觀察到了階段RNA的生成規(guī)律（補(bǔ)充圖S11）。因此，我們將該區(qū)域視為AtTAS4的同源基因座，它包含位于D4（-）區(qū)域的假定小RNA，我們稱其為AcTAS4-D4（-）。檢測(cè)到五種潛在的miR828前體（稱為MIR828a-e），其中兩種類型的成熟miR826是由這些前體產(chǎn)生的。miRNA活性的雙熒光素酶分析支持這五種前體產(chǎn)生成熟的miRNA（miR858a至e），隨后切割A(yù)cTAS4（圖5b）。

將含有MIR828a、AcTAS4和MIR829a+AcTAS44的農(nóng)桿菌滲透到本氏菌葉片中。RT-qPCR檢測(cè)葉片中phasiRNA的生成；當(dāng)用空載體或MIR828a注射時(shí)，在煙葉中不能檢測(cè)到AcTAS4-D4（-）。然而，當(dāng)MIR828a和AcTAS4的混合物被滲透時(shí)，AcTAS4-D4（-）的豐度顯著增加。單獨(dú)滲透的AcTAS4也會(huì)導(dǎo)致AcTAS4-D4（-）出現(xiàn)，這可能由內(nèi)源性煙草miR828觸發(fā)（圖5c）。此外，miRNA雙熒光素酶分析進(jìn)一步顯示AcTAS4-D4（-）可以有效切割MYB110（圖5d）。MYB10和MYB110是擬南芥亞群S6 MYB的同源物。在先前的研究中，AtMYB75（AtPAP1）、AtMYB 90（AtPAP2）和AtMYB113被預(yù)測(cè)受AtTAS4-siR81（-）調(diào)控。

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Fig. 5

在獼猴桃中，MYB110被TAS4位點(diǎn)產(chǎn)生的phasiRNA切割，盡管與擬南芥有一些核苷酸差異（圖6a）。然而，分析表明MYB10將逃脫AcTAS4-D4（-）和AtTAS4-siR81（-）的切割（圖6a）。當(dāng)與AcTAS4-D4（-）共滲透時(shí)，MYB110的花青素誘導(dǎo)活性顯著降低（圖6b；補(bǔ)充圖S12a），但對(duì)MYB10驅(qū)動(dòng)的花青苷積累沒有影響（圖6a；補(bǔ)充圖S2b）。當(dāng)MYB110中AcTAS4-D4（-）的靶位點(diǎn)突變時(shí)，在不改變氨基酸序列的情況下（補(bǔ)充圖S13），它不再受AcTAS4-D4（-1）的調(diào)控。過度表達(dá)結(jié)果表明，MYB110在獼猴桃中產(chǎn)生暗紅色愈傷組織，而MYB110m產(chǎn)生黑色愈傷組織（圖6c）。MYB110m愈傷組織中的花青素積累量是MYB110的三到六倍（圖6d和e），雖然呈黑色，但提取時(shí)呈深紅色。

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Fig. 6

3.5 miRNA靶向介導(dǎo)的miRNA對(duì)MYB10的抑制

由于MYB10不受表達(dá)的miRNA或AcTAS4-D4（-）直接調(diào)控，我們研究了可能影響MYB12活性的其他抑制機(jī)制。研究了涉及miRNA的其他靶點(diǎn)的間接調(diào)控。根據(jù)我們的目標(biāo)預(yù)測(cè)（通過psRobot軟件），每個(gè)miRNA通常針對(duì)一類特定的基因，其中許多是轉(zhuǎn)錄因子（補(bǔ)充表S3）。這些轉(zhuǎn)錄因子包括SQUAMOSA啟動(dòng)子結(jié)合蛋白樣（SPL）、生長(zhǎng)素應(yīng)答因子（ARF）、SCL和APETALA2（AP2）。為每個(gè)miRNA選擇一個(gè)有代表性的靶基因，然后進(jìn)行miRNA雙熒光素酶測(cè)定，以確定這些基因是否被相應(yīng)的miRNA直接抑制。

實(shí)驗(yàn)證實(shí)所有靶轉(zhuǎn)錄因子都被相應(yīng)的差異表達(dá)miRNA（DEmiRNA；圖7a）切割。為了測(cè)試DEmiRNA對(duì)花青素積累的間接調(diào)節(jié)，在miRNA結(jié)合位點(diǎn)突變所有靶基因（氨基酸序列未改變），以防止由同源內(nèi)源性煙草miRNA驅(qū)動(dòng)的任何影響（補(bǔ)充圖S14）。

使用這些突變的TF構(gòu)建體，進(jìn)行顯色瞬時(shí)分析，以評(píng)估靶點(diǎn)對(duì)MYB10的抑制作用。顯色分析清楚地表明SPL13（Acc29651；或SQBP28）、ARF16（Acc08534）、SCL6（Acc15797；或GRAS76）和F-box1（Acc08265）可有效抑制MYB12（圖7b；補(bǔ)充圖S15）。其中，ARF16和F-box1的效果最為顯著，而SPL13和SCL6可以將花青素積累減少到40-50%（圖7b；補(bǔ)充圖S15）。這些結(jié)果表明，一組抑制性轉(zhuǎn)錄因子本身是miRNAs的靶標(biāo)，可以介導(dǎo)MYB10蛋白活性的抑制，并可能在果實(shí)外果皮中起作用。

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Fig. 7

3.6 miRNA靶向抑制MYB10是通過MBW轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中MYB110的競(jìng)爭(zhēng)實(shí)現(xiàn)的

從煙草中花青素積累的結(jié)果來看，一組miRNA靶點(diǎn)通過抑制MYB10蛋白影響花青素的積累。亞群6分支的MYB通過形成MYB-bHLH-WD40復(fù)合物控制花青素生物合成。因此，進(jìn)行熒光素酶測(cè)定以測(cè)試miRNA靶點(diǎn)是否改變MBW復(fù)合物。熒光素酶的C端（CLUC）或-N端（NLUC）與靶蛋白或MBW復(fù)合物的成員融合。正如預(yù)期的那樣，SPL13（Acc29651）、ARF16（Acc08534）、SCL6（Acc15797）和F-box1（Acc08265）的過度表達(dá)顯著降低了MYB10和bHLH5的相互作用（獼猴桃bHLH4，Acc19563；圖8a）。四種最強(qiáng)的抑制因子中有三種是轉(zhuǎn)錄因子SPL13、ARF16和SCL6。

此外，螢火蟲熒光素酶互補(bǔ)分析支持SPL13，ARF16及SCL6可以結(jié)合MYB10蛋白形成蛋白-蛋白復(fù)合物（圖8b）。因此，似乎miRNA靶點(diǎn)SPL13、ARF16和SCL6可以通過與MBW復(fù)合物競(jìng)爭(zhēng)MYB10來抑制花青素積累。F-box1（Acc08265）蛋白被注釋為屬于E3泛素連接酶家族的蛋白質(zhì)，其參與蛋白質(zhì)降解。F-box1能夠減少由MYB10驅(qū)動(dòng)的花青素積累并干擾MBW復(fù)合物（圖7b，8a）。

此外，F-box1的過度表達(dá)導(dǎo)致MYB10-LUC融合蛋白的熒光素酶活性降低（圖8c）和MYB10蛋白降解（圖8d）。這些結(jié)果表明，F-box1通過泛素化途徑直接靶向MYB10蛋白降解。因此，miRNA靶點(diǎn)F-box1也可以通過蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換影響MYB10。

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Fig. 8

04

結(jié)論

獼猴桃果肉中花青素的外觀由兩種MYB激活劑MYB10（紅色內(nèi)果皮）和MYB110（紅色全果肉）確定（圖9）。MYB10和MYB110可能起源于祖先的MYB，在基因復(fù)制后具有亞功能化。蛋白質(zhì)C末端的兩個(gè)關(guān)鍵基序被表征并直接影響MYB活性的強(qiáng)度。MYB110被小RNA AcTAS4-D4（-）直接切割，由miR828觸發(fā)。MYB10被miRNA的基因靶標(biāo)廣泛抑制，這些miRNA在外果皮中的表達(dá)低于內(nèi)果皮，導(dǎo)致MYB11抑制。這項(xiàng)研究揭示了獼猴桃色素沉著的激活抑制系統(tǒng)。

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Fig. 9

05

獲取原文

原文鏈接：

https://nph.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/nph.18122

PDF獲取：

https://www.scientsgene.com/h-nd-116.html#_np=107_423

文末附件.

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總結(jié)

以上是生活随笔為你收集整理的猕猴桃的红色果肉受到特定的激活-抑制系统的控制的全部?jī)?nèi)容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問題。

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