易基因｜ChIP-seq等實驗揭示CHD6轉錄激活前列腺癌通路的關鍵功能 | 腫瘤耐藥研究

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2022年11月21日，北京大學基礎醫學院趙東宇研究員、美國休斯敦衛理公會研究所Min Zhang為并列第一作者，美國西北大學醫學院曹圻博士和哈佛大學醫學院陳開富博士、張麗麗博士為共同通訊作者在《Nucleic Acids Research》雜志發表了題為“CHD6 promotes broad nucleosome eviction for transcriptional activation in prostate cancer cells”的研究論文，該研究通過對CHD6的ChIP-seq、MNase-seq和RNA-seq等實驗揭示了CHD6與染色質結合，從啟動子和基因體中清除核小體（nucleosome）以轉錄激活前列腺癌通路。

標題：CHD6 promotes broad nucleosome eviction for transcriptional activation in prostate cancer cells

時間：2022.11.21

期刊：Nucleic Acids Research

影響因子：IF 19.16

技術平臺：ChIP-seq、MNase-seq、RNA-seq

樣本實驗：人前列腺癌細胞系培養，質粒、轉染、慢病毒和逆轉錄病毒的產生和感染，RT-qPCR和western blot，細胞功能檢測，小鼠腫瘤異種移植，雞絨毛膜尿囊膜（CAM）檢測，高斯熒光素酶（GLuc）報告基因檢測，ChIP-seq，MNase-seq，RNA-seq，統計分析

研究摘要：

CHD6是染色質域解旋酶DNA結合蛋白家族的一員，但人們對CHD6在染色質重塑和癌癥疾病中的確切作用還知之甚少。本研究表明CHD6結合染色質進行核小體廣泛“驅逐（eviction）“以促進多種癌癥通路的轉錄激活。作者納入多個患者隊列對1000多個前列腺癌數據集進行生物信息學分析，發現CHD6在前列腺癌中的表達上調，并與不良預后相關。進一步綜合實驗表明，CHD6在小鼠異種移植模型中調控前列腺癌細胞的致癌性和腫瘤進展。對CHD6進行ChIP-seq、MNase-seq和RNA-seq分析，結果表明CHD6結合染色質，將核小體從啟動子和基因體中”驅逐“，以轉錄激活致癌通路。本研究結果證明了CHD6在轉錄激活前列腺癌通路中的關鍵作用。

結果圖形

（1）CHD6在前列腺癌中表達上調并與不良預后相關

圖1：CHD6表達上調導致前列腺癌發生。

GEO公共數據庫中，良性前列腺組織（BP，n=28）、局限性前列腺癌（PC，n=59）和轉移性前列腺癌（mPC，n=35）中的CHD6 RNA表達水平。

SU2C轉移性前列腺癌患者中CHD6 RNA表達與腫瘤含量之間的關系散點圖，顯示了Spearman相關系數（r）和P值。

TCGA數據中PSA水平高和低的前列腺癌患者的CHD6 RNA表達水平。（n低=181，n高=46）。

Taylor數據中高和低腫瘤分期的前列腺癌患者的CHD6 RNA表達水平。（n低=86，n高=55）。

個體條件下，RT-qPCR檢測的C4-2細胞中CHD6 mRNA表達水平（上）和Western blot檢測的蛋白質在C4-2細胞中的表達水平（下）。

個體條件下，C4-2細胞集落形成。

個體條件下，C4-2細胞增殖。

個體條件下的C4-2細胞Transwell侵襲實驗。

經0.5μM絲裂霉素c（MMC）處理的C4-2細胞增殖。

經0.5μM絲裂霉素c（MMC）處理的C4-2細胞傷口愈合實驗。

個體條件下BPH-1細胞的傷口愈合實驗。

個體條件下BPH-1細胞Transwell侵襲實驗。

OE：過表達；Vec：對照組；sh，shRNA；shScr，scramble control for shRNA。

（2）CHD6是體內前列腺癌生長和侵襲所必需的

圖2：在小鼠異種移植模型中CHD6敲除阻礙前列腺癌細胞的腫瘤生長和轉移。

A-B. C4-2對照和CHD6敲除細胞形成的腫瘤。

C-E. C4-2對照和CHD6敲除細胞的腫瘤體積（C）、發光強度（D）和重量（E）。

F. 通過qPCR檢測C4-2對照和CHD6敲除細胞的小鼠肺中HPRT基因位點的人基因組DNA含量。

G. C4-2細胞的腫瘤蘇木精和伊紅染色。紅色箭頭表示肌肉侵襲區域。

H. Lower雞胚絨毛尿囊膜(CAM)中C4-2-GFP對照和CHD6敲除細胞的代表性圖像。綠色熒光點：GFP標記的C4-2細胞，黑色：血管。

I-J. qPCR定量檢測CAM腫瘤模型的雞肺（I）和肝臟（J）中Alu基因位點的人基因組DNA含量。

Sh表示shRNA；shScr，表示scramble control for shRNA；P值由雙尾學生t檢驗確定。小鼠實驗（A-C），N=8。對照胚胎N=5、sh2胚胎N=5、sh1胚胎N=6（H-J），每個胚胎三個技術重復。*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001，n.s., 無顯著意義。比例尺：100μm。

（3）CHD6激活的基因表達與前列腺癌患者預后不良相關

圖3：CHD6激活的基因表達與前列腺癌患者預后不良相關

C4-2細胞CHD6敲除后下調或上調的基因表達水平熱圖。

C4-2細胞中FDR決定cutoffs時，CHD6激活或抑制的基因數量。

C4-2細胞中CHD6激活或抑制基因的KEGG通路分析。

TCGA數據中CHD6激活標記基因高或低RNA表達的前列腺癌患者無病生存率的Kaplan-Meier圖。

TCGA數據中不同腫瘤階段CHD6激活標記基因的RNA表達水平。（n低=186，n中=293，n高=10）。

TCGA數據中PSA水平低和高的患者CHD6激活標記基因的RNA表達水平。（n低=181，n高=46）。

CHD6激活基因的GO分析。

單尾Wilcoxon檢驗（E，F）確定P值。結果基于三個獨立的生物學重復整合得出。

（4）癌基因E2F1在前列腺癌中受CHD6轉錄調控

圖4：許多致癌轉錄因子是CHD6的下游標靶。

GSEA分析顯示C4-2細胞中CHD6調控基因的1639個轉錄因子富集。

C4-2細胞中CHD6激活的70個轉錄因子KEGG通路分析。

C4-2細胞中CHD6敲除后轉錄因子的表達變化火山圖。

基因組瀏覽器軌跡分析顯示單個樣本中CHD6位點的RNA-seq數據

基因組瀏覽器軌跡分析顯示單個樣本中E2F1位點的RNA-seq數據。

個體條件下C4-2細胞中CHD6和E2F1的蛋白水平。

GSEA分析顯示C4-2細胞中CHD6調控基因中E2F1激活和抑制基因富集。

個體條件下的C4-2細胞增殖。

個體條件下C4-2細胞的Transwell侵襲實驗。

（5）CHD6在染色質上的結合與癌癥通路的轉錄激活有關

圖5：CHD6蛋白在染色質上的結合與C4-2細胞中靶基因的轉錄激活有關。

C4-2細胞中CHD6的 ChIP-seq 顯示基因組的基因體和附近區域的read分布。

基因組瀏覽器軌跡顯示C4-2細胞中示例基因的CHD6 ChIP-seq read分布。

ChIP-qPCR驗證C4-2對照和CHD6敲除細胞中的CHD6 ChIP-Seq富集位點。

GSEA分析顯示CHD6激活或抑制基因的富集與基因體上CHD6 ChIP-seq read分布的關系。

（6）CHD6在染色質上的結合是清除核小體激活轉錄所必需的

圖6：CHD6蛋白在染色質上的結合與C4-2細胞中活性基因的核小體驅逐有關。

C4-2對照細胞中MNase-seq富集peaks周圍繪制的MNase-seq和CHD6 ChIP-seq平均 read分布。

C4-2對照細胞和CHD6敲除細胞在對照細胞中定義的CHD6 ChIP-seq富集peaks周圍的平均MNase-seq read分布。

C4-2對照細胞和CHD6敲除細胞中E2F1基因體周圍繪制的MNase-seq read分布。

C4-2對照細胞和CHD6敲除細胞中SGK1基因體周圍繪制的MNase-seq read分布，右上角的方框圖進一步顯示MNase -seq Read分布差異

基因組瀏覽器軌跡顯示基因組區域中的MNase-seq、CHD6 ChIP-seq和input read分布。

CHD6敲除后CHD6結合和MNase peak增加的KEGG通路分析

CHD6敲除后CHD6結合和MNase peak增加的GO通路分析

GSEA分析顯示在MNase-seq信號增加或減少中CHD6激活基因（上）或CHD6抑制基因（下）的富集情況。MNase -seq設置3個生物學重復。

結論：

本研究利用染色質免疫共沉淀測序 (ChIP-seq) 和轉錄組測序（RNA-seq）、MNase-seq等技術，證明了CHD6基因表達在前列腺癌樣品中上調，且是前列腺癌細胞快速生長和進展所必需的。前列腺癌細胞中CHD6表達升高的機制尚待確定。雄激素受體(androgen receptor，AR)在前列腺癌中起關鍵作用，CHD6的表達水平與前列腺癌樣品中的AR表達呈正相關，且CHD6敲除不能影響AR的表達水平（數據未顯示），這表明AR可能上調前列腺癌中的CHD6。這些結果可能是前列腺癌中CHD6活性增加的原因。此外研究還發現，與對照組織相比，原發性前列腺癌中CHD3、CHD4和CHD9的基因表達水平顯著降低。盡管這三個CHD家族成員在其他癌癥類型中具有多種作用，但未來進一步研究它們在前列腺癌中的下調及潛在機制是很有意義的。新出現的證據表明，染色質重塑因子的功能失調導致了耐藥性。去勢抵抗性前列腺癌(CRPC)中CHD1缺失導致染色質結構失調，導致轉錄因子表達上調，從而導致抗雄激素耐藥性。與CHD1相反，本研究初步數據顯示CHD6在CRPC中進一步上調，表明CHD6在CRPC的發展和對抗雄激素治療的耐藥性出現中具有明顯作用。

關于易基因染色質免疫共沉淀測序 (ChIP-seq) 技術

染色質免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation,ChIP），是研究體內蛋白質與DNA相互作用的經典方法。將ChIP與高通量測序技術相結合的ChIP-Seq技術，可在全基因組范圍對特定蛋白的DNA結合位點進行高效而準確的篩選與鑒定，為研究的深入開展打下基礎。

DNA與蛋白質的相互作用與基因的轉錄、染色質的空間構型和構象密切相關。運用組蛋白特定修飾的特異性抗體或DNA結合蛋白或轉錄因子特異性抗體富集與其結合的DNA片段，并進行純化和文庫構建，然后進行高通量測序，通過將獲得的數據與參考基因組精確比對，研究人員可獲得全基因組范圍內某種修飾類型的特定組蛋白或轉錄因子與基因組DNA序列之間的關系，也可對多個樣品進行差異比較。

應用方向：

ChIP 用來在空間上和時間上不同蛋白沿基因或基因組定位

• 轉錄因子和輔因子結合作用
• 復制因子和 DNA 修復蛋白
• 組蛋白修飾和變異組蛋白

技術優勢：

• 物種范圍廣：細胞、動物組織、植物組織、細菌微生物多物種富集經驗；
• 微量建庫：只需5ng以上免疫沉淀后的DNA，即可展開測序分析；
• 方案靈活：根據不同的項目需求，選擇不同的組蛋白修飾特異性抗體。

易基因科技提供全面的表觀遺傳學研究整體解決方案，技術詳情了解請致電易基因0755-28317900。

參考文獻：

Zhao D, Zhang M, Huang S, Liu Q, Zhu S, Li Y, Jiang W, Kiss DL, Cao Q, Zhang L, Chen K. CHD6 promotes broad nucleosome eviction for transcriptional activation in prostate cancer cells. Nucleic Acids Res. 2022 Nov 21. pii: 6835365.

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總結

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