易基因｜ChIP-seq等實(shí)驗(yàn)揭示CHD6轉(zhuǎn)錄激活前列腺癌通路的關(guān)鍵功能 | 腫瘤耐藥研究

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2022年11月21日，北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院趙東宇研究員、美國(guó)休斯敦衛(wèi)理公會(huì)研究所Min Zhang為并列第一作者，美國(guó)西北大學(xué)醫(yī)學(xué)院曹圻博士和哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院陳開(kāi)富博士、張麗麗博士為共同通訊作者在《Nucleic Acids Research》雜志發(fā)表了題為“CHD6 promotes broad nucleosome eviction for transcriptional activation in prostate cancer cells”的研究論文，該研究通過(guò)對(duì)CHD6的ChIP-seq、MNase-seq和RNA-seq等實(shí)驗(yàn)揭示了CHD6與染色質(zhì)結(jié)合，從啟動(dòng)子和基因體中清除核小體（nucleosome）以轉(zhuǎn)錄激活前列腺癌通路。

標(biāo)題：CHD6 promotes broad nucleosome eviction for transcriptional activation in prostate cancer cells

時(shí)間：2022.11.21

期刊：Nucleic Acids Research

影響因子：IF 19.16

技術(shù)平臺(tái)：ChIP-seq、MNase-seq、RNA-seq

樣本實(shí)驗(yàn)：人前列腺癌細(xì)胞系培養(yǎng)，質(zhì)粒、轉(zhuǎn)染、慢病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒的產(chǎn)生和感染，RT-qPCR和western blot，細(xì)胞功能檢測(cè)，小鼠腫瘤異種移植，雞絨毛膜尿囊膜（CAM）檢測(cè)，高斯熒光素酶（GLuc）報(bào)告基因檢測(cè)，ChIP-seq，MNase-seq，RNA-seq，統(tǒng)計(jì)分析

研究摘要：

CHD6是染色質(zhì)域解旋酶DNA結(jié)合蛋白家族的一員，但人們對(duì)CHD6在染色質(zhì)重塑和癌癥疾病中的確切作用還知之甚少。本研究表明CHD6結(jié)合染色質(zhì)進(jìn)行核小體廣泛“驅(qū)逐（eviction）“以促進(jìn)多種癌癥通路的轉(zhuǎn)錄激活。作者納入多個(gè)患者隊(duì)列對(duì)1000多個(gè)前列腺癌數(shù)據(jù)集進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)CHD6在前列腺癌中的表達(dá)上調(diào)，并與不良預(yù)后相關(guān)。進(jìn)一步綜合實(shí)驗(yàn)表明，CHD6在小鼠異種移植模型中調(diào)控前列腺癌細(xì)胞的致癌性和腫瘤進(jìn)展。對(duì)CHD6進(jìn)行ChIP-seq、MNase-seq和RNA-seq分析，結(jié)果表明CHD6結(jié)合染色質(zhì)，將核小體從啟動(dòng)子和基因體中”驅(qū)逐“，以轉(zhuǎn)錄激活致癌通路。本研究結(jié)果證明了CHD6在轉(zhuǎn)錄激活前列腺癌通路中的關(guān)鍵作用。

結(jié)果圖形

（1）CHD6在前列腺癌中表達(dá)上調(diào)并與不良預(yù)后相關(guān)

圖1：CHD6表達(dá)上調(diào)導(dǎo)致前列腺癌發(fā)生。

GEO公共數(shù)據(jù)庫(kù)中，良性前列腺組織（BP，n=28）、局限性前列腺癌（PC，n=59）和轉(zhuǎn)移性前列腺癌（mPC，n=35）中的CHD6 RNA表達(dá)水平。

SU2C轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者中CHD6 RNA表達(dá)與腫瘤含量之間的關(guān)系散點(diǎn)圖，顯示了Spearman相關(guān)系數(shù)（r）和P值。

TCGA數(shù)據(jù)中PSA水平高和低的前列腺癌患者的CHD6 RNA表達(dá)水平。（n低=181，n高=46）。

Taylor數(shù)據(jù)中高和低腫瘤分期的前列腺癌患者的CHD6 RNA表達(dá)水平。（n低=86，n高=55）。

個(gè)體條件下，RT-qPCR檢測(cè)的C4-2細(xì)胞中CHD6 mRNA表達(dá)水平（上）和Western blot檢測(cè)的蛋白質(zhì)在C4-2細(xì)胞中的表達(dá)水平（下）。

個(gè)體條件下，C4-2細(xì)胞集落形成。

個(gè)體條件下，C4-2細(xì)胞增殖。

個(gè)體條件下的C4-2細(xì)胞Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)。

經(jīng)0.5μM絲裂霉素c（MMC）處理的C4-2細(xì)胞增殖。

經(jīng)0.5μM絲裂霉素c（MMC）處理的C4-2細(xì)胞傷口愈合實(shí)驗(yàn)。

個(gè)體條件下BPH-1細(xì)胞的傷口愈合實(shí)驗(yàn)。

個(gè)體條件下BPH-1細(xì)胞Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)。

OE：過(guò)表達(dá)；Vec：對(duì)照組；sh，shRNA；shScr，scramble control for shRNA。

（2）CHD6是體內(nèi)前列腺癌生長(zhǎng)和侵襲所必需的

圖2：在小鼠異種移植模型中CHD6敲除阻礙前列腺癌細(xì)胞的腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。

A-B. C4-2對(duì)照和CHD6敲除細(xì)胞形成的腫瘤。

C-E. C4-2對(duì)照和CHD6敲除細(xì)胞的腫瘤體積（C）、發(fā)光強(qiáng)度（D）和重量（E）。

F. 通過(guò)qPCR檢測(cè)C4-2對(duì)照和CHD6敲除細(xì)胞的小鼠肺中HPRT基因位點(diǎn)的人基因組DNA含量。

G. C4-2細(xì)胞的腫瘤蘇木精和伊紅染色。紅色箭頭表示肌肉侵襲區(qū)域。

H. Lower雞胚絨毛尿囊膜(CAM)中C4-2-GFP對(duì)照和CHD6敲除細(xì)胞的代表性圖像。綠色熒光點(diǎn)：GFP標(biāo)記的C4-2細(xì)胞，黑色：血管。

I-J. qPCR定量檢測(cè)CAM腫瘤模型的雞肺（I）和肝臟（J）中Alu基因位點(diǎn)的人基因組DNA含量。

Sh表示shRNA；shScr，表示scramble control for shRNA；P值由雙尾學(xué)生t檢驗(yàn)確定。小鼠實(shí)驗(yàn)（A-C），N=8。對(duì)照胚胎N=5、sh2胚胎N=5、sh1胚胎N=6（H-J），每個(gè)胚胎三個(gè)技術(shù)重復(fù)。*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001，n.s., 無(wú)顯著意義。比例尺：100μm。

（3）CHD6激活的基因表達(dá)與前列腺癌患者預(yù)后不良相關(guān)

圖3：CHD6激活的基因表達(dá)與前列腺癌患者預(yù)后不良相關(guān)

C4-2細(xì)胞CHD6敲除后下調(diào)或上調(diào)的基因表達(dá)水平熱圖。

C4-2細(xì)胞中FDR決定cutoffs時(shí)，CHD6激活或抑制的基因數(shù)量。

C4-2細(xì)胞中CHD6激活或抑制基因的KEGG通路分析。

TCGA數(shù)據(jù)中CHD6激活標(biāo)記基因高或低RNA表達(dá)的前列腺癌患者無(wú)病生存率的Kaplan-Meier圖。

TCGA數(shù)據(jù)中不同腫瘤階段CHD6激活標(biāo)記基因的RNA表達(dá)水平。（n低=186，n中=293，n高=10）。

TCGA數(shù)據(jù)中PSA水平低和高的患者CHD6激活標(biāo)記基因的RNA表達(dá)水平。（n低=181，n高=46）。

CHD6激活基因的GO分析。

單尾Wilcoxon檢驗(yàn)（E，F）確定P值。結(jié)果基于三個(gè)獨(dú)立的生物學(xué)重復(fù)整合得出。

（4）癌基因E2F1在前列腺癌中受CHD6轉(zhuǎn)錄調(diào)控

圖4：許多致癌轉(zhuǎn)錄因子是CHD6的下游標(biāo)靶。

GSEA分析顯示C4-2細(xì)胞中CHD6調(diào)控基因的1639個(gè)轉(zhuǎn)錄因子富集。

C4-2細(xì)胞中CHD6激活的70個(gè)轉(zhuǎn)錄因子KEGG通路分析。

C4-2細(xì)胞中CHD6敲除后轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)變化火山圖。

基因組瀏覽器軌跡分析顯示單個(gè)樣本中CHD6位點(diǎn)的RNA-seq數(shù)據(jù)

基因組瀏覽器軌跡分析顯示單個(gè)樣本中E2F1位點(diǎn)的RNA-seq數(shù)據(jù)。

個(gè)體條件下C4-2細(xì)胞中CHD6和E2F1的蛋白水平。

GSEA分析顯示C4-2細(xì)胞中CHD6調(diào)控基因中E2F1激活和抑制基因富集。

個(gè)體條件下的C4-2細(xì)胞增殖。

個(gè)體條件下C4-2細(xì)胞的Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)。

（5）CHD6在染色質(zhì)上的結(jié)合與癌癥通路的轉(zhuǎn)錄激活有關(guān)

圖5：CHD6蛋白在染色質(zhì)上的結(jié)合與C4-2細(xì)胞中靶基因的轉(zhuǎn)錄激活有關(guān)。

C4-2細(xì)胞中CHD6的 ChIP-seq 顯示基因組的基因體和附近區(qū)域的read分布。

基因組瀏覽器軌跡顯示C4-2細(xì)胞中示例基因的CHD6 ChIP-seq read分布。

ChIP-qPCR驗(yàn)證C4-2對(duì)照和CHD6敲除細(xì)胞中的CHD6 ChIP-Seq富集位點(diǎn)。

GSEA分析顯示CHD6激活或抑制基因的富集與基因體上CHD6 ChIP-seq read分布的關(guān)系。

（6）CHD6在染色質(zhì)上的結(jié)合是清除核小體激活轉(zhuǎn)錄所必需的

圖6：CHD6蛋白在染色質(zhì)上的結(jié)合與C4-2細(xì)胞中活性基因的核小體驅(qū)逐有關(guān)。

C4-2對(duì)照細(xì)胞中MNase-seq富集peaks周?chē)L制的MNase-seq和CHD6 ChIP-seq平均 read分布。

C4-2對(duì)照細(xì)胞和CHD6敲除細(xì)胞在對(duì)照細(xì)胞中定義的CHD6 ChIP-seq富集peaks周?chē)钠骄鵐Nase-seq read分布。

C4-2對(duì)照細(xì)胞和CHD6敲除細(xì)胞中E2F1基因體周?chē)L制的MNase-seq read分布。

C4-2對(duì)照細(xì)胞和CHD6敲除細(xì)胞中SGK1基因體周?chē)L制的MNase-seq read分布，右上角的方框圖進(jìn)一步顯示MNase -seq Read分布差異

基因組瀏覽器軌跡顯示基因組區(qū)域中的MNase-seq、CHD6 ChIP-seq和input read分布。

CHD6敲除后CHD6結(jié)合和MNase peak增加的KEGG通路分析

CHD6敲除后CHD6結(jié)合和MNase peak增加的GO通路分析

GSEA分析顯示在MNase-seq信號(hào)增加或減少中CHD6激活基因（上）或CHD6抑制基因（下）的富集情況。MNase -seq設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

結(jié)論：

本研究利用染色質(zhì)免疫共沉淀測(cè)序 (ChIP-seq) 和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq）、MNase-seq等技術(shù)，證明了CHD6基因表達(dá)在前列腺癌樣品中上調(diào)，且是前列腺癌細(xì)胞快速生長(zhǎng)和進(jìn)展所必需的。前列腺癌細(xì)胞中CHD6表達(dá)升高的機(jī)制尚待確定。雄激素受體(androgen receptor，AR)在前列腺癌中起關(guān)鍵作用，CHD6的表達(dá)水平與前列腺癌樣品中的AR表達(dá)呈正相關(guān)，且CHD6敲除不能影響AR的表達(dá)水平（數(shù)據(jù)未顯示），這表明AR可能上調(diào)前列腺癌中的CHD6。這些結(jié)果可能是前列腺癌中CHD6活性增加的原因。此外研究還發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組織相比，原發(fā)性前列腺癌中CHD3、CHD4和CHD9的基因表達(dá)水平顯著降低。盡管這三個(gè)CHD家族成員在其他癌癥類(lèi)型中具有多種作用，但未來(lái)進(jìn)一步研究它們?cè)谇傲邢侔┲械南抡{(diào)及潛在機(jī)制是很有意義的。新出現(xiàn)的證據(jù)表明，染色質(zhì)重塑因子的功能失調(diào)導(dǎo)致了耐藥性。去勢(shì)抵抗性前列腺癌(CRPC)中CHD1缺失導(dǎo)致染色質(zhì)結(jié)構(gòu)失調(diào)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)上調(diào)，從而導(dǎo)致抗雄激素耐藥性。與CHD1相反，本研究初步數(shù)據(jù)顯示CHD6在CRPC中進(jìn)一步上調(diào)，表明CHD6在CRPC的發(fā)展和對(duì)抗雄激素治療的耐藥性出現(xiàn)中具有明顯作用。

關(guān)于易基因染色質(zhì)免疫共沉淀測(cè)序 (ChIP-seq) 技術(shù)

染色質(zhì)免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation,ChIP），是研究體內(nèi)蛋白質(zhì)與DNA相互作用的經(jīng)典方法。將ChIP與高通量測(cè)序技術(shù)相結(jié)合的ChIP-Seq技術(shù)，可在全基因組范圍對(duì)特定蛋白的DNA結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行高效而準(zhǔn)確的篩選與鑒定，為研究的深入開(kāi)展打下基礎(chǔ)。

DNA與蛋白質(zhì)的相互作用與基因的轉(zhuǎn)錄、染色質(zhì)的空間構(gòu)型和構(gòu)象密切相關(guān)。運(yùn)用組蛋白特定修飾的特異性抗體或DNA結(jié)合蛋白或轉(zhuǎn)錄因子特異性抗體富集與其結(jié)合的DNA片段，并進(jìn)行純化和文庫(kù)構(gòu)建，然后進(jìn)行高通量測(cè)序，通過(guò)將獲得的數(shù)據(jù)與參考基因組精確比對(duì)，研究人員可獲得全基因組范圍內(nèi)某種修飾類(lèi)型的特定組蛋白或轉(zhuǎn)錄因子與基因組DNA序列之間的關(guān)系，也可對(duì)多個(gè)樣品進(jìn)行差異比較。

應(yīng)用方向：

ChIP 用來(lái)在空間上和時(shí)間上不同蛋白沿基因或基因組定位

• 轉(zhuǎn)錄因子和輔因子結(jié)合作用
• 復(fù)制因子和 DNA 修復(fù)蛋白
• 組蛋白修飾和變異組蛋白

技術(shù)優(yōu)勢(shì)：

• 物種范圍廣：細(xì)胞、動(dòng)物組織、植物組織、細(xì)菌微生物多物種富集經(jīng)驗(yàn)；
• 微量建庫(kù)：只需5ng以上免疫沉淀后的DNA，即可展開(kāi)測(cè)序分析；
• 方案靈活：根據(jù)不同的項(xiàng)目需求，選擇不同的組蛋白修飾特異性抗體。

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參考文獻(xiàn)：

Zhao D, Zhang M, Huang S, Liu Q, Zhu S, Li Y, Jiang W, Kiss DL, Cao Q, Zhang L, Chen K. CHD6 promotes broad nucleosome eviction for transcriptional activation in prostate cancer cells. Nucleic Acids Res. 2022 Nov 21. pii: 6835365.

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總結(jié)

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