MetaQuast：評估宏基因組拼接

MetaQUAST: evaluation of metagenome assemblies

Bioinformatics, [4.531]

2015-11-26 Method

DOI: https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btv697

第一作者：Alla Mikheenko

通訊作者：Alexey Gurevich

其它作者：Vladislav Saveliev

作者主要單位：

圣彼得堡國立大學(xué)轉(zhuǎn)化生物醫(yī)學(xué)研究所算法生物技術(shù)中心，圣彼得堡199034，俄羅斯(Center for Algorithmic Biotechnology, Institute of Translational Biomedicine, St. Petersburg State University, St. Petersburg 199034, Russia)

熱心腸日報

MetaQUAST是一款專門針對宏基因組拼接結(jié)果評估的工具；

評估主要步驟包括比對參考序列確定未知物種含量，提供基于多樣性參考基因組的綜合報告，通過檢測嵌合重疊群確定是否存在高度相關(guān)的物種；

通過4種常用拼接工具分析一個模擬數(shù)據(jù)集和兩個真實數(shù)據(jù)集的結(jié)果進(jìn)行評估，測試結(jié)果表明MetaQUAST性能良好，同時發(fā)現(xiàn)沒有一個軟件在各方面都能優(yōu)于其它軟件；

該軟件可為用戶選擇適合的拼接工具提供指導(dǎo)。

點評：宏基因組拼接軟件眾多，但由于缺少參考數(shù)據(jù)庫，拼接結(jié)果評估困難。QUAST是2013年發(fā)表于Bioinformatics，是一款非常流行的基因組拼接結(jié)果評估軟件，引用1759次。2016年又推出了專門針對宏基因組的MetaQUAST版本，引用125次(引用統(tǒng)計截止19年9月17日)。

摘要

簡介：在過去的幾年中，我們目睹了新的宏基因組拼接方法的快速發(fā)展。盡管有許多針對單基因組裝配的基準(zhǔn)實用程序，但是沒有公認(rèn)的用于宏基因組特異性類似物的評估和比較工具。在本文中，我們提出了MetaQUAST，它是QUAST的一種修改版本，是基于重疊群與參照對齊的基因組拼接評估的最先進(jìn)工具。MetaQUAST通過檢測這些宏基因組數(shù)據(jù)集的特征：(i)未知物種含量通過與下載的參考序列比對來確定;(ii)提供巨大多樣性的多個基因組的綜合報告；(iii)通過檢測嵌合重疊群而存在高度相關(guān)的物種。我們通過比較一個模擬數(shù)據(jù)集和兩個真實數(shù)據(jù)集上的幾個主要組裝軟件來演示MetaQUAST性能。

可用性和實施：http://quast.sourceforge.net/metaquast

軟件主頁，已經(jīng)更新至3.2版本，網(wǎng)站也更新，并隨整合為QUAST中的一部分

對四種宏基因組拼接軟件基于MetaHIT數(shù)據(jù)組裝結(jié)果比較

聯(lián)系方式：aleksey.gurevich@spbu.ru

1 背景

1 Introduction

宏基因組學(xué)研究直接取自環(huán)境樣品的遺傳物質(zhì)。NGS技術(shù)允許甚至從低豐度生物體中測序短讀長而無需克隆。然而，在這些實驗中產(chǎn)生的數(shù)據(jù)往往是巨大的，嘈雜的，并且包含來自數(shù)千種物種的片段，其豐度和同源性變化很大。這些挑戰(zhàn)導(dǎo)致了宏基因組裝的新計算問題，其次是多種方法(Boisvert等，2012; Peng等，2012; Haider等，2014)，這需要標(biāo)準(zhǔn)的基準(zhǔn)程序進(jìn)行比較。

大多數(shù)現(xiàn)有的組裝評估方法不適用于宏基因組。然而，存在計算關(guān)于組裝的讀長可能性的方法(Clark等人，2013; Ghodsi等人，2013)，或確定單拷貝保守的普遍存在的基因含量(Parks等人，2015; Simao等人，J.Biol.Chem.2007,1987)。，2015)。不幸的是，沒有一個使用重疊群比對與密切相關(guān)的參考基因組。在本文中，我們介紹了MetaQUAST，這是一種基于QUAST的宏基因組特異性修改版軟件(Gurevich等，2013)。QUAST基于與給定的密切相關(guān)的參考基因組的比對來檢測錯誤，并且還報告和繪制諸如N50和基因含量的重疊群統(tǒng)計數(shù)據(jù)，其甚至在沒有用戶提供參考序列的情況下給出了組成物種的概述。為了解釋宏基因組拼接，MetaQUAST增加了幾個新功能：(i)使用無限數(shù)量參考基因組的能力，(ii)自動物種內(nèi)容檢測，(iii)嵌合重疊群的檢測(種間錯誤組裝)和(iv)顯著的重新設(shè)計

2 材料和方法

2.1 基于參考的評估

有充分研究的具有已知物種含量的宏基因組數(shù)據(jù)集(Qin等，2010)或模擬數(shù)據(jù)(Boisvert等，2012; Namiki等，2012)。它們可與MetaQUAST一起用于評估基于參考基因組比對的裝配方法。多參考數(shù)據(jù)庫的流程包括以下四個主要步驟(附圖S1)：

附圖1. 基于參考數(shù)據(jù)庫的評估流程

MetaQUAST pipeline for reference-based evaluation

所有參考基因組都連接成一個文件(組合參考)。QUAST輸入所有輸入組裝結(jié)果與參考數(shù)據(jù)。我們強(qiáng)制QUAST報告所有不確定的比對，而不是僅報告一個。對于包含密切相關(guān)物種的宏基因組數(shù)據(jù)集，所有模糊比對都是必不可少的。

我們將所有重疊群分成組，每組包含映射到特定參考基因組的序列(基于先前產(chǎn)生的比對)。映射到幾個基因組的重疊群的組。無法比對的重疊群被放入一個額外的組中。

接下來，分別為每個輸入?yún)⒖紨?shù)據(jù)庫分別運(yùn)行QUAST，為其提供相應(yīng)的一組重疊群。無法比對的重疊群組不再進(jìn)行比對。

最后，所有QUAST運(yùn)行的結(jié)果將組合在一起，形成摘要報告和可視化。用戶可以查看每次運(yùn)行的詳細(xì)完整QUAST輸出，以及整個數(shù)據(jù)集結(jié)果的概覽。

除了QUAST標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量統(tǒng)計數(shù)據(jù)集(N50，基因組比例genome fraction等)之外，我們還添加了兩個指標(biāo)：

• 種間易位(interspecies translocations)數(shù)量：一種錯誤組裝，其中側(cè)翼序列與不同的參考序列對齊[類似于(Gurevich等人2013)中引入的易位，其中側(cè)翼序列與不同的染色體對齊]。

• 可能錯誤組裝的重疊群的數(shù)量：包含重疊群大部分對齊和未對齊片段的數(shù)量，因此可能包含具有未知基因組的種間易位。

與使用GeneMarkS的常規(guī)QUAST相比，MetaQUAST使用MetaGeneMark(Zhu等，2010)進(jìn)行基因預(yù)測，該基因預(yù)測是專門為宏基因組開發(fā)的。

2.2 從頭評估

2.2 De novoevaluation

多數(shù)實驗宏基因組學(xué)研究使用的是從頭組裝，而沒有參考信息。在沒有輸入?yún)⒖夹蛄谢蛭锓N列表的情況下執(zhí)行MetaQUAST時，它將嘗試識別物種含量并自動提取參考序列。請注意，該算法在假設(shè)研究人員對微生物群落最感興趣的前提下工作，因此搜索僅限于細(xì)菌和古細(xì)菌。

工作流程(請參見附圖S2)首先應(yīng)用BLASTn(Camacho等，2009)將重疊群與SILVA數(shù)據(jù)庫中的16S rRNA序列進(jìn)行比對(Quast等，2012)。幾乎所有微生物物種中都存在的16S亞基是高度保守的序列，但還包括一個高變區(qū)，可用于將生物分類。對于每個檢測到的物種，具有最高評分的一個菌株將保留在組裝中。

查詢針對NCBI的物種對對應(yīng)豐度的前50名，下載每個物種的最少片段的序列。由于已知的問題與生物之間的rRNA操縱子的拷貝數(shù)不同以及16S基因的基因組內(nèi)部異質(zhì)性不同，某些下載的基因組序列可能在所評估的組裝中不具有代表性。MetaQUAST嘗試通過除去重疊群覆蓋率小于10％(對于所有組裝)的基因組來過濾假陽性。在特殊情況下，當(dāng)所有序列的基因組分?jǐn)?shù)都非常低時，該列表將保持未經(jīng)過濾的狀態(tài)。

結(jié)果，我們獲得了可能由組裝序列代表的一組基因組。我們使用這些序列(如2.1節(jié)中所示)啟動MetaQUAST，并產(chǎn)生與常規(guī)基于參考的分析相同的輸出文件。

我們的方法是準(zhǔn)確性和時間/內(nèi)存消耗之間的折衷。為了獲得更精確的結(jié)果，我們建議使用MGTAXA(Williamson et al。，2012)或基于精確讀長比對的方法，例如Kraken(Wood and Salzberg，2014)或CLARK(Ounit et al。，2015)。通過對整個NCBI-nr數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLASTx(Altschul等，1990)搜索可以獲得非常精確的結(jié)果。所獲取的物種名稱列表可以以純文本格式輸入到MetaQUAST，使其從NCBI數(shù)據(jù)庫下載指定的序列，并將其用于基于參考的評估(請參閱第2.1節(jié))。

2.3 根據(jù)讀長比對細(xì)化裝配錯誤

Refining misassemblies based on read mapping

常規(guī)的單基因組QUAST算法將重疊群和參考基因組之間的結(jié)構(gòu)差異報告為錯配。但是，在某些情況下，它們證明可能是結(jié)構(gòu)變異(SV)，而不是真實的裝配錯誤。在分析沒有相近參考序列的宏基因組學(xué)群落時，這一點尤其重要。MetaQUAST通過考慮配對讀長映射解決了這個問題(附圖S3)。MetaQUAST應(yīng)用結(jié)構(gòu)變異查找算法來基于不一致的讀對檢測斷點，然后將其用于消除共享的斷點breakpoints。

2.3.1 SV檢測

SV detection

MetaQUAST利用bowtie2(Langmead等人，2009)對組合的參考基因組進(jìn)行讀長比對。bowtie2生成的BAM文件(Li等，2009)按坐標(biāo)排序，并作為SV發(fā)現(xiàn)軟件的輸入。我們選擇了Manta(Chen等人，2015)SV挖掘軟件，在我們的測試數(shù)據(jù)集上，其靈敏度和精度均優(yōu)于LUMPY(Layer等人，2014)和Pindel(Ye等人，2009)。

2.3.2 組裝錯誤分類

Misassembly classification

將QUAST報告的每個組裝錯誤與所有發(fā)現(xiàn)的SV的斷點置信區(qū)間進(jìn)行比較。如果錯誤組裝的開始和結(jié)束坐標(biāo)都在SV間隔內(nèi)擴(kuò)展了一個小δ，則MetaQUAST會將此錯誤組裝標(biāo)記為假的，并且將不包括在最終報告中。如果在SV和錯誤組裝之間未發(fā)現(xiàn)相似之處，則認(rèn)為是真實的。默認(rèn)δ值為100 bp，這是基于對真實和模擬數(shù)據(jù)集上出現(xiàn)的數(shù)十個SV進(jìn)行手動分析的經(jīng)驗結(jié)果。

這種方法使我們能夠顯著減少所有三個測試數(shù)據(jù)集上錯誤報告的組裝錯誤的數(shù)量。有關(guān)詳細(xì)的基準(zhǔn)測試結(jié)果，請參見補(bǔ)充材料。

2.4 可視化

Visualization

MetaQUAST通過大量鳥瞰圖補(bǔ)充了QUAST可視化效果。此外，還將生成一個交互式摘要HTML報告，該報告結(jié)合了所有程序集和引用的關(guān)鍵統(tǒng)計信息。圖表和摘要HTML在補(bǔ)充材料中進(jìn)行了演示。

我們將匯總圖分為三組：

• 錯配Misassembly圖：按類型(錯位relocations，倒位inversions，易位translocations和種間易位)進(jìn)行錯位分布。它們以兩種視圖形式存在：所有組裝/參考序列和所有參考/組裝。

• 公制級別Metric-level的圖：對于所有組裝和所有參考序列，每個公制都有一個。基因組是從所有裝配中的平均值排序，從最佳開始。

• Krona圖表(Ondov等人，2011年)：每個組裝一張，整個數(shù)據(jù)集一張。圓圖顯示了分類概況。僅在從頭評估模式下可用。

交互式摘要HTML報告匯總了所有統(tǒng)計信息，參考序列和組裝的表和圖。每個表格行均顯示組合參考的值，并且可以展開以顯示每個參考的值(請參見圖1)。藍(lán)色/紅色熱圖強(qiáng)調(diào)離群值。

圖1. 基于MetaHIT數(shù)據(jù)集的HTML格式報告部分截圖

Part of a summary HTML report for the MetaHIT dataset.

每個單元格按內(nèi)容著色。在示例中，每個參考基因組比例的信息擴(kuò)展開來。

結(jié)果

Results

我們在三個數(shù)據(jù)集上測試了MetaQUAST：CAMI(http://cami-challenge.org)模擬群落數(shù)據(jù)集，MetaHit的MH0045樣本和HMP的SRS077736舌背女性樣本(人類微生物組計劃等，2012)。我們使用在宏基因組學(xué)研究中常用的四種主要組裝程序?qū)@些數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接：IDBA-UD(Peng等人，2012)，SPAdes(Bankevich等人，2012)，Ray Meta(Boisvert等人，2012)和SOAPdenovo2(Luo等人，2012年)。補(bǔ)充材料中展示了所有三個數(shù)據(jù)集的比較結(jié)果和MetaQUAST性能。

對這些數(shù)據(jù)集的比較表明，沒有任何組裝程序可以稱為宏基因組學(xué)拼接中無可爭議的領(lǐng)導(dǎo)者。因此，諸如MetaQUAST之類的工具對群落而言具有重要的現(xiàn)實意義。這將幫助科學(xué)家評估不同的組裝軟件，并為他們的研究選擇最佳的分析。

Reference

Alexey Gurevich, Vladislav Saveliev, Nikolay Vyahhi & Glenn Tesler. QUAST: quality assessment tool for genome assemblies. Bioinformatics. 2013, 29: 1072-1075. doi:10.1093/bioinformatics/btt086

Alla Mikheenko, Vladislav Saveliev & Alexey Gurevich. MetaQUAST: evaluation of metagenome assemblies. Bioinformatics. 2016, 32: 1088-1090. doi:10.1093/bioinformatics/btv697

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寫在后面

學(xué)習(xí)擴(kuò)增子、宏基因組科研思路和分析實戰(zhàn)，關(guān)注“宏基因組”

創(chuàng)作挑戰(zhàn)賽新人創(chuàng)作獎勵來咯，堅持創(chuàng)作打卡瓜分現(xiàn)金大獎

總結(jié)

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