1.簡介

SSRMMD (Simple Sequence Repeat Molecular Marker Developer) 是用Perl語言編寫的軟件，可以從組裝序列(FASTA格式，例如：基因組或轉錄組)中檢測完美的SSR位點和候選的多態性SSR。該軟件還包含了一個名為connectorToPrimer3的程序，此程序提供了SSRMMD到Primer3的接口，使得可以輕松地進行批量SSR引物設計。

2.軟件下載與安裝

下載地址：https://github.com/GouXiangJian/SSRMMD

安裝方法：不管是在linux還是在windows中運行，都是解壓即用。

3.軟件使用：SSR位點檢測

3.1在linux中運行

[重要參數]

解壓軟件后，將當前工作目錄切進軟件內部(cd SSRMMD-master)，在命令行輸入perl SSRMMD.pl -h，即可查看該軟件的幫助文檔，其中有幾個參數對于SSR位點的檢測比較重要，例如：

-f1 : 用于檢測SSR位點的FASTA格式的文件 (必須提供該參數!)

-e : 指定檢測SSR位點的方法 (默認設置: 0, 可選的值: 0 [這種方法速度更快], 1 [這種方法類似于MISA軟件使用的方法])

-mo : SSR基序的閾值 (默認設置: 1=10,2=7,3=6,4=5,5=4,6=4 [其中, 等號左邊是基序的長度, 等號右邊是最小重復次數])

-l : SSR的側翼序列的長度 (默認設置: 100)

-ss : 是否輸出SSR的統計文件 (默認設置: 0, 可選的值: 0 [表示不輸出], 1 [表示輸出])

-t : 運行軟件時使用的線程數 (默認設置: 1)

[運行示例]

以軟件自帶的例子文件example1.fa舉例，如果想要：(1) 修改SSR基序的閾值設置，(2) 將SSR的側翼序列設置為200bp，(3) 輸出SSR的統計文件，(4) 使用2線程來運行程序，則命令行可以這樣輸入：

perl SSRMMD.pl -f1 example/input/example1.fa -mo 2=6,3=5,4=4 -l 200 -ss 1 -t 2

[運行輸出]

運行完成后，會在當前目錄下創建一個名為SSRMMDOUT的目錄，里面包含SSR信息文件example1.fa.SSRs，以及SSR統計文件example1.fa.stat。

3.2在windows中運行

如果想在windows中用上述同樣的命令運行SSRMMD，則需要事先安裝Perl的解釋器，下載地址為：https://www.perl.org/。好消息是，該軟件包中提供了一個已經編譯好的版本SSRMMD.exe，位于bin目錄中。因此，可以直接使用它而不必再安裝Perl的解釋器了。

解壓軟件后，將當前工作目錄切進軟件內部(cd SSRMMD-master/bin)，在命令行輸入SSRMMD.exe -h，即可查看該軟件的幫助文檔。

[運行示例]

若用上述同樣的參數配置來運行，則命令行可以這樣輸入：

SSRMMD.exe -f1 ../example/input/example1.fa -mo 2=6,3=5,4=4 -l 200 -ss 1 -t 2

[運行輸出]

類似地，運行完成后，會在當前目錄下創建一個名為SSRMMDOUT的目錄，里面包含SSR信息文件example1.fa.SSRs，以及SSR統計文件example1.fa.stat。

4.軟件使用：多態性SSR篩選

4.1在linux中運行

[重要參數]

如果想要進一步篩選多態性SSR，則必須準備兩個fasta格式的組裝文件。SSRMMD會在這兩個文件之間，對SSR的側翼序列率先進行保守性評估，隨后進行唯一性評估。

類似地，幫助文檔中有幾個參數對于多態性SSR篩選比較重要，例如：

-me : 指定檢測側翼序列保守性的算法 (默認設置: NO, 可選的值: NO [僅僅使用HASH, 該方法非常快, 但是只能檢索出側翼序列絕對保守的SSR], LD [使用Levenshtein-Distance算法], NW [使用Needleman–Wunsch算法])

-d : 當參數-me設置為LD時, 設置由Levenshtein-Distance算法計算的側翼序列保守性的閾值 (默認設置: 0.05)

-i : 當參數-me設置為NW時, 設置由Needleman-Wunsch算法計算的側翼序列保守性的閾值 (默認設置: 0.95)

-st : 指定檢測側翼序列唯一性的計算方式 (默認設置: 0, 可選的值: 0 [節約時間], 1 [節約內存])

[運行示例]

以軟件自帶的例子文件example1.fa和example2.fa舉例，如果想要：(1) 使用Needleman–Wunsch算法來評估側翼序列的保守性，(2) 以節約時間的方式來評估側翼序列的唯一性，(3) 使用2線程來運行程序，則命令行可以這樣輸入：

perl SSRMMD.pl -f1 example/input/example1.fa -f2 example/input/example2.fa -p 1 -me NW -st 0 -t 2

[運行輸出]

運行完成后，會在當前目錄下創建一個名為SSRMMDOUT的目錄，里面包含SSR信息文件example1.fa.SSRs和example2.fa.SSRs，以及多態SSR記錄文件example1.fa-and-example2.fa.compare。

4.2在windows中運行

[運行示例]

若用上述同樣的參數配置來運行，則命令行可以這樣輸入：

SSRMMD.exe -f1 ../example/input/example1.fa -f2 ../example/input/example2.fa -p 1 -me NW -st 0 -t 2

[運行輸出]

類似地，運行完成后，會在當前目錄下創建一個名為SSRMMDOUT的目錄，里面包含SSR信息文件example1.fa.SSRs和example2.fa.SSRs，以及多態SSR記錄文件example1.fa-and-example2.fa.compare。

5.軟件使用：批量SSR引物設計

5.1在linux中運行

目錄connectorToPrimer3中的腳本connectorToPrimer3.pl可以輕松地將SSRMMD與Primer3結合起來，以實現批量SSR引物設計。在命令行輸入perl connectorToPrimer3/connectorToPrimer3.pl -h，即可查看該腳本的幫助文檔。

若用默認的參數配置設計引物，則命令行可以這樣輸入：

#Design primers for all SSRs (SSRMMD option '-p' = 0)

perl connectorToPrimer3/connectorToPrimer3.pl -i SSRMMDOUT/example1.fa.SSRs -o all.txt

#Design primers for candidate polymorphic SSRs (SSRMMD option '-p' = 1)

perl connectorToPrimer3/connectorToPrimer3.pl -i SSRMMDOUT/example1.fa-and-example2.fa.compare -o poly.txt -s 2

5.2在windows中運行

類似地，腳本connectorToPrimer3.pl也有一個已經編譯好的版本connectorToPrimer3.exe，位于bin目錄中。

若用默認的參數配置設計引物，則命令行可以這樣輸入：

#Design primers for all SSRs (SSRMMD option '-p' = 0)

connectorToPrimer3.exe -i SSRMMDOUT/example1.fa.SSRs -o all.txt

#Design primers for candidate polymorphic SSRs (SSRMMD option '-p' = 1)

connectorToPrimer3.exe -i SSRMMDOUT/example1.fa-and-example2.fa.compare -o poly.txt -s 2

總結

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