題目 & 作者

有兩篇介紹該軟件的論文，一篇是2018年的，第二篇是2022年的。第二篇主要是對軟件使用流程的詳細介紹。

emClarity: software for high-resolution cryo-electron tomography and subtomogram averaging
Benjamin A. Himes, Peijun Zhang(通訊）
2018，Nature methods

High-resolution in situ structure determination by cryo-electron tomography and subtomogram averaging using emClarity
Peijun Zhang(通訊）
2022，Nature Protocols

首先是第一篇論文的大致內容：

摘要

大分子復合物本質上是柔性的，通常很難通過單粒子低溫電子顯微鏡（cryo EM）純化以確定其結構。這種復合物可以通過低溫電子層析成像（cryo ET）結合子斷層對齊和分類進行研究，在特殊情況下可以達到亞納米級分辨率，從而深入了解結構-功能關系。然而，將這種方法應用于表現出混雜或成分異質性或豐度較低的樣本仍然具有挑戰性。

為了解決這個問題，本文開發了emClarity（wiki），這是一個GPU加速的圖像處理軟件包，其特點是一種迭代層析傾斜序列優化算法，該算法使用子斷層圖作為基準標記，以及一種3D采樣函數補償的多尺度主成分分析分類方法。我們證明，與目前最先進的軟件相比，我們的方法在分辨率和大分子復合物不同功能狀態的分離方面有了實質性的改進。

本文將精力集中在那些可能產生最大改進的圖像處理領域：傾斜序列對齊的準確性，改進的散焦測定和對比度傳遞函數（CTF）校正，各向異性分辨率的顯式處理，以及更穩健的分類。

Results

emClarity workflow

如圖所示，新的功能由紅色文字標出。

Step 1. input data

原始數據用的是傾斜序列和它的對齊參數的初始估計（使用 IMOD 得到）。

Step 2. tomogram WBP & template matching with 3D interactive editing.

受分辨率限制，用傳統的加權背投影足以重建初始tomograms，不需要CTF矯正。

Step 3. 3D-CTF-corrected WBP

為了校正沿光軸的散焦梯度（樣本厚度），emClarity使用了一種簡單版本的散焦梯度校正反投影。該方法最近得到驗證，并更名為3D-CTF correction。為了平衡精度和實際計算時間，emClarity根據當前分辨率和離焦確定可接受的厚度。對于這種厚度的每塊板，我們將功率譜變白，乘以確定的CTF，并根據累積電子劑量進行過濾。對于傾斜圖像，從全圖像的傅里葉逆變換乘以相應的CTF中提取與當前接受的離焦相對應的寬度條帶。

Step 4. subtomogram averaging, CTF amplitude correction, and anisotropic spectral SNR weighting.

emClarity 中的迭代對齊過程在使用當前估計方向的子斷層圖平均和缺失楔約束的互相關網格搜索之間交替。 除了數據量之外，還獲得了“3D 采樣函數”的平均值，這類似于加權 3D CTF 模型。 另外考慮了在斷層圖像重建期間應用的 R 加權。 為避免與“3D-CTF correction”混淆，稱之為“3D sampling function”。

Step 5: 3D-sampling-function-compensated iterative refinement of subtomogram alignment.

冷凍電鏡中常用的迭代細化程序容易出現噪聲擬合的錯誤，稱為過擬合。 為了最大限度地減少過度擬合，emClarity 將數據從一開始分成兩半，在優化過程中保持分開，采用所謂的黃金標準方法。

此外，約束搜索中使用的參考會經過仔細過濾。 在每個循環中，平均值的光譜 SNR (SSNR) 由 FSC 估計。 然后，通過我們對重建后體積歸一化單粒子維納濾波器的適應，將源自該 FSC 的 figure-of-merit weighting 與 CTF 幅度恢復相結合。 這種適應涉及對信號分布中的方向各向異性的明確說明。

迭代過程是一種局部細化，它改進了在模板匹配期間獲得的初始全局對齊。 我們將嘈雜的粒子旋轉回顯微鏡參考框架中，以與參考體積進行互相關； 這允許將對稱性應用于粒子，從而提高方向搜索中的 SNR。 這在 SPA 中是不可能的，其中粒子是一個投影，并且參考必須旋轉到粒子的方向，據我們所知，它沒有在任何其他 subtomogram 平均包中實現。

Step 6: iterative refinement of tilt-series alignment

emClarity 通過使用子斷層圖作為基準標記來實現傾斜系列對齊的迭代細化，稱為tomoCPR 過程。這類似于在 RELION 中 SPA 的“particle polishing”，但有兩個主要區別。

首先，為細化原始傾斜系列中子斷層圖基準標記的位置而生成的參考投影包括來自相鄰粒子的信息，以及斷層圖中存在的非粒子信息。

其次，tomoCPR 約束空間上鄰近的粒子，以便它們在給定的投影中表現相似，就像在 SPA 中一樣，同時還要求它們作為一個組通過傾斜序列從一個投影到另一個投影平滑變化。一組圖像變換（位移、平面內旋轉、傾斜角和放大倍數）適合重疊斑塊的網格，每個斑塊包含固定數量的粒子，由總分子量決定。使用 IMOD 的 Tiltalign 解決了將給定補丁中所有基準點在所有投影上的誤差最小化的單組圖像轉換。由于補丁顯著重疊（0.75），圖像變換在相鄰粒子上平滑變化。

Step 7: 3D-sampling-function-compensated classification

可以通過在平均結構上疊加 3D“方差圖”來可視化數據集中存在顯著差異的區域。缺失楔會產生特定于樣品中每個粒子方向的偽影，但不一定與其身份或構象有關。如果不進行校正，這些偽影會掩蓋粒子之間有意義的差異，從而導致整個數據集的擴散方差。
先前展示的一種通過使用稱為楔形掩蔽差異的二進制掩碼來估計丟失楔形影響的技術被證明是一種很好的一階校正。然而，當考慮更高分辨率的特征時，該模型的準確性會下降。

為了在分類中提供更高分辨率的信息，我們用 3D 采樣函數替換了這個二元楔形掩模，這導致了對缺失楔引入的偽影的更準確估計。值得注意的是，這不會“填充”任何缺失的數據；相反，它通過粒子的 3D 采樣函數扭曲當前的子斷層圖平均值來估計給定粒子的外觀，并根據該預期值與觀察到的粒子之間的差異進行聚類。

Step 8: multi-scale clustering

我們通過在生物學相關的長度尺度上引入體素間相關性來編碼先驗生物學信息，例如~10 ? 用于 α-螺旋密度，18-20 ? 用于 RNA 螺旋或小蛋白質結構域，~40 ? 用于較大蛋白質 域。 我們通過使用帶通濾波器選擇給定長度尺度的特征來實現這一點。 使用原生 MATLAB 函數 SVD 在每個長度尺度上運行奇異值分解，然后將描述每個長度尺度的最大方差的奇異向量連接成特征向量以進行進一步的聚類。 雖然這種方法與其他領域應用的多尺度、多變量統計分析的現有思想相似，但由于 emClarity 同時考慮了每個長度尺度，它能夠提供對特征空間的更豐富的描述。

Discussion

我們創建了一套圖像處理程序，并將其整合到emClarity程序中，與當前最先進的方法相比，該程序在對齊和圖像恢復方面顯示出了更高的精度。我們的目標是使 emClarity 盡可能易于使用，將用戶指定的參數限制為普通顯微鏡和數據收集信息，以及粒子半徑和質量的估計。用戶還必須選擇角度搜索范圍，這在將來可能會有所改進。

我們通過將楔形差異校正與多尺度聚類相結合，展示了一種在缺失楔效應情況下進行圖像分類的強大方法，這有助于為聚類算法編碼生物相關信息。除了用較小的種群分離出分辨率良好的類平均值，并在能量場中找到附近的最小值外，我們的方法還產生了精確的3D方差圖。

因為它突出了動態行為的關鍵區域，所以對直接分析和互補生物物理實驗的設計有用。雖然分類方面的這些進展尚處于預處理和降維階段，但未來探索模式識別和機器學習中的現代方法的工作可能會使該技術得到實質性的改進。

Methods

Datasets

EMPIAR-10045：80S ribosome
EMPIAR-10064：mammalian 80S ribosome
EMPIAR-10164：HIV-1 immature Gag

Programs

命令行形式運行。
注：emClarity 目前是沒有 GUI 的。

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下面是第二篇論文的一些改進和補充：

Introduction

emClarity 中實現了幾個關鍵功能。

估計了傾斜序列內每個傾斜圖像的散焦和散光，以計算對比度傳遞函數 (CTF)。然后在斷層圖像重建期間校正圖像的 CTF 調制效果，考慮景深。

為了在對齊、重建和分類期間進行準確加權，emClarity 計算 3D 采樣函數 (3DSF)。每個子斷層圖像的 3DSF 解釋了丟失的楔形信息，在處理的每個步驟中都會更新并用作權重。

為了解決樣本異質性問題，emClarity 實現了基于多尺度 3DSF 加權、主成分分析 (PCA) 的分類方法，允許用戶強調不同長度尺度的特定特征。

局部標本運動和變形對 STA 重建的質量造成重大限制。 emClarity 實施了斷層圖像約束投影細化 (tomoCPR)，通過使用子斷層圖像作為基準標記來細化樣本中的局部位移、旋轉和放大變化。這改善了傾斜系列對齊，特別是對于從低溫聚焦離子束研磨薄片記錄的原位 cryoET 數據集，其中使用金珠基準沒有意義，因為它們會在研磨過程中被移除。

基本流程：

Prerequisite

了解 Etomo 中的 fiducial based alignment；

了解 PCA 和常用的聚類算法，對在進行 subtomo 分類時有用；

提供了一個教程，以 EMPIAR-10303 為例進行分步處理。

limitations：

emClarity 使用了模板匹配的挑顆粒算法，需要用戶使用模板，建議使用低通濾波后的模板來減小模板bias。

也可以使用 Dynamo、PEET 生成初始模板。

建議對齊原始傾斜序列時，使用 emClarity autoAlign 或 Etomo、AreTomo，tomoCPR 的結果有時可能不好。

Materials

環境要求

GPU 內存 >12 GB
CUDA > 9

Input data

raw tilt series
原始圖像需要做 motion-correction，但不用曝光加權，這由 emClarity 內部處理。 傾斜系列中的運動校正圖像應按傾斜角度的順序排列，例如，從 -60° 到 60°。 傾斜序列可以使用 Etomo 等外部軟件包進行對齊并導入到 emClarity。 用戶還可以導入原始傾斜系列并使用 emClarity 自動對齊。

metadata
顯微鏡成像條件：電壓、像素大小、離焦范圍、幅度對比度和 Cs
數據收集方案（傾斜序列中圖像采集的順序和曝光劑量）使用參數文件來管理輸入，通常命名以反映其功能和周期。

References

溫馨指路：

The emClarity software ：wiki
The tutorial documentation：tutorial

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$$Author:Chier$$

總結

以上是生活随笔為你收集整理的【冷冻电镜|论文阅读】emClarity：用于高分辨率冷冻电子断层扫描和子断层平均的软件的全部內容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問題。

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