全基因組重亞硫酸鹽測序（whole genome bisulfite sequencing） 表觀遺傳學研究已經(jīng)證實了特定基因區(qū)域的DNA甲基化修飾對于染色體構(gòu)象、基因表達調(diào)控機制有著重要影響，而全基因組DNA甲基化研究將是表觀基因組學最為關注的內(nèi)容之一。

Bisulfite處理能夠?qū)⒒蚪M中未發(fā)生甲基化的C堿基轉(zhuǎn)換成U，進行PCR擴增后變成T，與原本具有甲基化修飾的C堿基區(qū)分開來，再結(jié)合 高通量測序 技術，可繪制單堿基分辨率的全基因組DNA甲基化圖譜。

特定物種的高精確度甲基化修飾模式的分析，必將在表觀基因組學研究中具有里程碑式的意義，并且為細胞分化、組織發(fā)育等基礎機制研究，以及動植物育種、人類健康與疾病研究奠定基礎。

技術優(yōu)勢：

■單堿基精確度：精確分析每一個C堿基的甲基化狀態(tài)。

■里程碑式的研究：特定物種的表觀基因組學研究的重要內(nèi)容，適用于所有具有精確基因組圖譜的物種。


實驗流程：

● 基因組DNAA超聲打斷至100-500bp的片段

● DNA片段末端修復、3’端加A堿基，連接測序接頭。

● 采用 EZ DNA Methylattion-Gold kit 進行 Bisulfite 處理

● 脫鹽處理，PCR擴增后進行文庫片段大小選擇。

● 合格的文庫用于上機測序。

1. Data Clean
測序結(jié)果進行去污染，去接頭處理。根據(jù)測序產(chǎn)生的序列文件*.fq 統(tǒng)計read
長度，read數(shù)量，數(shù)據(jù)產(chǎn)量。

2. 標準信息分析
2.1 Bisulfite-seeq 序列與參考序列的比對

在信息分析過程中，首先將每一對reads中正鏈reads上的C堿基轉(zhuǎn)換為T堿基，而反鏈 reads中的G堿基轉(zhuǎn)換為A堿基。在此基礎上使用SOAP軟件，將reads與參考基因組序列進行比對，唯一比對reads將用于甲基化信息的分析。數(shù)據(jù)比對統(tǒng)計結(jié)果如下：

2.2 C堿基測序深度的累積分布

甲基化C堿基在基因組上的分布包含三種形式（CG, CHG和CHH，其中H代表A 或T或C堿基）。下述圖表中反映了三種不同分布類型的C堿基的測序深度累積分布。其中橫軸表示C堿基測序深度，縱軸表示一定測序深度下C堿基的累積比例( copynum <=1.5即uniquely mapped reads的判斷標準之一)。

堿基測序深度的累積分布圖

2.3 不同reads測序深度下的基因組覆蓋度

橫軸表示測序深度，縱軸表示特定測序深度下所對應的基因組覆蓋度。

2.4 計算C堿基的甲基化水平

每一個甲基化C堿基的甲基化水平均按如下公式進行計算：100*reads/total reads（例如：CpG位點的甲基化率=100*支持CG甲基化的reads/支持甲基化的 reads+支持非甲基化的reads）全基因組平均甲基化水平反應了基因組甲基化圖譜的總體特征。

Average methylation level for C, CG, CHG and CHH

Pattern	C	CG	CHG	CHH
Mathylation level	5.00	80.88	4.89	1.22

2.5 全基因組甲基化數(shù)據(jù)分布趨勢

甲基化C堿基中CG, CHGG與CHH 的分布比例

不同分布類型的甲基化C位點在不同物種基因組中出現(xiàn)比例不同，因此，各類型mC( mCG、mCHG和mCHH ) 的位點數(shù)目，及其在全部mC的位點中所占的比例(例：mCHG所占比例= mCHG數(shù)目/mC的總數(shù))，在一定程度上反映了特定物種的全基因組甲基化圖譜的特征。

不同分布類型甲基化 C 的數(shù)量及比例

Pattern	mCG	mCHG	mCHH
Number	1,409,380	4,890	47,583
Proportion	96.41	0.33	3.25

此外，還統(tǒng)計如下數(shù)據(jù)：

● CG、CHG和CHH中的所有C的甲基化水平

● 各個染色體中CG、CHG和CHH中C的甲基化水平

● 統(tǒng)計不同基因區(qū)域內(nèi)CG、CHG和CHH中C的甲基化水平

● 不同基因元件區(qū)域中CG、CHG和CHH中C的甲基化水平

● CHG、CHH中甲基化C附近的9bp序列的序列特征分析

2.6 全基因組DNA甲基化圖譜

染色體水平的甲基化C堿基的密度分布

從染色體水平來描述甲基C堿基的的分布情況。藍點表示以10kb的窗口統(tǒng)計甲基化C堿基的密度在染色體上的分布情況，光滑曲線則表示不同類型甲基化C堿基( G、CHG和CHH )的密度分布。

染色體上甲基化C密度分布

全基國組不同功能元件區(qū)域的甲基化水平分布

2.7差異性甲基化區(qū)域（DMR）分析

在兩個樣品基因組相同位置上尋找包含5個CG的窗口，用CG甲基化水平的差異來尋找甲基化有差異的區(qū)域。確定每條染色體上有差異的區(qū)域長度和有差異的基因，并對這些基因做 GO 聚類功能分析，以分析差異相關基因是否有明顯的功能聚類，即是否針對性地調(diào)控行使某類功能。DMR分析須基于兩個樣品進行差異比較。

DMR相關基因的GO聚類分析

總結(jié)

以上是生活随笔為你收集整理的Bisulfite Sequencing的全部內(nèi)容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問題。

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