我們用來練手的文章發(fā)表在 Nature Communication ，"High contiguity Arabidopsis thaliana genome assembly with a single nanopore flow cell", 非常不要臉的說，這篇文章是我?guī)煚攲?shí)驗(yàn)室發(fā)的。

簡單講講故事內(nèi)容，就是他們實(shí)驗(yàn)室買了一臺(tái)nanopore儀器，就是下面這臺(tái)， 目前儀器價(jià)格國內(nèi)是8K左右，當(dāng)然測(cè)序的價(jià)格就另說了。如同買臺(tái)PS4主機(jī)，還要買游戲，買個(gè)單反，你還得買鏡頭。儀器只是敗家的開始！

他們認(rèn)為三代測(cè)序目前有兩大問題，測(cè)的還不夠長以及不夠準(zhǔn)。nanopore解決了其中一個(gè)問題，不夠長。Arabidopsis thaliana 當(dāng)年用一代測(cè)序，雖然可以認(rèn)為是組裝的金標(biāo)準(zhǔn)了，但是還是有很多區(qū)域是BAC連BAC文庫搞不定的，所以就用這臺(tái)儀器把 Arabidopsis thaliana 測(cè)了一波。顯然就測(cè)一個(gè)nanopore，還是已知序列的物種是不可能發(fā)文章的，于是他們又用Pacbio sequel測(cè)了一波。最后用bionano 光學(xué)圖譜驗(yàn)證了一次(請(qǐng)大家自行計(jì)算要多少錢)。

光測(cè)序不行，還得組裝對(duì)吧。傳統(tǒng)的組裝方法是想辦法利用高深度和隨機(jī)錯(cuò)誤進(jìn)行糾錯(cuò)，然后用糾錯(cuò)后的長序列進(jìn)行組裝，最后用二代進(jìn)行糾錯(cuò)。對(duì)于一臺(tái)不錯(cuò)的服務(wù)器(20W起步吧)大約花個(gè)十天半個(gè)月就行。作者或許認(rèn)為買一臺(tái)20多w的外設(shè)配合不到1w的測(cè)序儀可能是太蠢了，于是他用了比較Li Heng大神開發(fā)的工具，Minimap+miniasm進(jìn)行組裝，然后用racon+pillon進(jìn)行糾錯(cuò)，用了一臺(tái)Macbook Pro 15.6寸花了4天就搞定了，并且和常規(guī)工具比較，還算過得去哦。

下面就是正式的分析：

根據(jù)文章提供的項(xiàng)目編號(hào)"PRJEB21270", 在European Nucleotide Archive上找到下載地址。

進(jìn)入這個(gè)頁面之后，就可以去下載作者用到的所有數(shù)據(jù)，我們下載Sequel和MinIon和Illuminia的數(shù)據(jù)就好了，數(shù)據(jù)量加起來差不多30G。

## Sequal wget -c -q ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/ERA111/ERA1116568/bam/pb.bam wget -c -q ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/ERA111/ERA1116568/bam/pb.bam.bai ## MinION wget -c -q ftp://ftp.sra.ebi.ac.uk/vol1/ERA111/ERA1116595/fastq/ont.fq.gz

對(duì)于Illumina的二代測(cè)序，需要用prefetch進(jìn)行下載

# Illuminia MiSeq prefetch ERR2173372 fasterq-dump -O . ERR2173372

拿到數(shù)據(jù)之后，我們就可以用作者提供的分析流程進(jìn)行重復(fù)了。地址為https://github.com/fbemm/onefc-oneasm/wiki/Assembly-Generation

這就是大神的自信，把代碼都給你，反正你也看不懂。當(dāng)然我在重復(fù)的時(shí)候用的都是最新的軟件，所以會(huì)有所不同

第一步：拿著80%～90%正確率的原始數(shù)據(jù)相互比對(duì)， 找序列之間的Overlap。這一步，我花了30分鐘

time ~/opt/biosoft/minimap2/minimap2 -t 10 -x ava-ont ont.fq ont.fq > gzip -1 ont.paf.gz &

第二步：找到Overlap，就能夠進(jìn)行組裝了。這一步我花了2分鐘

time ~/opt/biosoft/miniasm/miniasm -f ont.fq ont.paf > ONTmin.gfa & awk '/^S/{print ">"$2"\n"$3}' ONTmin.gfa | seqkit seq > ONTmin_IT0.fasta &

第三步： 原始的組裝結(jié)果充滿了錯(cuò)誤，所以需要進(jìn)行糾錯(cuò)。糾錯(cuò)分為兩種，一種是用三代自身數(shù)據(jù)，一種是用二代數(shù)據(jù)進(jìn)行糾錯(cuò)。當(dāng)然這兩步都是需要的

首先使用三代數(shù)據(jù)進(jìn)行糾錯(cuò)，古語有云“事不過三”一般迭代個(gè)三次就差不多。這三步，差不多用了1個(gè)小時(shí)。

# Iteration 1 ~/opt/biosoft/minimap2/minimap2 ONTmin_IT0.fasta ont.fq > ONTmin_IT0.paf & time ~/opt/biosoft/racon/build/bin/racon -t 10 ont.fq ONTmin_IT0.paf ONTmin_IT0.fasta > ONTmin_IT1.fasta & # Iteration 2 ~/opt/biosoft/minimap2/minimap2 ONTmin_IT1.fasta ont.fq > ONTmin_IT1.paf time ~/opt/biosoft/racon/build/bin/racon -t 10 ont.fq ONTmin_IT1.paf ONTmin_IT1.fasta> ONTmin_IT2.fasta # Iteration 3 ~/opt/biosoft/minimap2/minimap2 ONTmin_IT2.fasta ont.fq > ONTmin_IT2.paf time ~/opt/biosoft/racon/build/bin/racon -t 10 ont.fq ONTmin_IT2.paf ONTmin_IT2.fasta > ONTmin_IT3.fasta

之后使用二代數(shù)據(jù)進(jìn)行糾錯(cuò)。二代數(shù)據(jù)雖然短，但是測(cè)序質(zhì)量高，所以一般都要用它進(jìn)行糾錯(cuò)。推薦用30X PCR free的illuminia 測(cè)序數(shù)據(jù)。

Step 1: 數(shù)據(jù)預(yù)處理，過濾低質(zhì)量短讀，去接頭。工具很多，常用的是trimmomatic，cutadapter. 我安利一個(gè)國內(nèi)海普洛斯搞的一個(gè)工具fastp。

# data clean fastp -q 30 -5 -l 100 -i ERR2173372_1.fastq -I ERR2173372_2.fastq -o i1_clean_1.fq -O i1_clean_2.fq

這里標(biāo)準(zhǔn)為：平均質(zhì)量高于Q30，對(duì)5‘端進(jìn)行低質(zhì)量堿基刪除，保留大于100bp的短讀

Step2: 比對(duì)，這一步基本都只用了bwa了

# align bwa index ONTmin_IT3.fasta bwa mem -t 8 ONTmin_IT3.fasta il_clean_1.fastq il_clean_2.fastq | samtools sort -@ 8 > ONTmin_IT3.bam

step3: 使用比對(duì)后的BAM文件進(jìn)行糾錯(cuò)

# short read consensus call java -Xmx16G -jar pilon-1.22.jar --genome ONTmin_IT3.fasta --frags ONTmin_IT3.bam --fix snps --output ONTmin_IT4

二代糾錯(cuò)的時(shí)間明顯比之前的久，需要一天時(shí)間。

大家拿出自己的筆記本實(shí)際感受下唄

參考文獻(xiàn)

• nanopore組裝擬南芥: High contiguity Arabidopsis thaliana genome assembly with a single nanopore flow cell
• 不糾錯(cuò)組裝: Minimap and miniasm: fast mapping and de novo assembly for noisy long sequences
• 三代組裝軟件評(píng)測(cè): Comprehensive evaluation of non-hybrid genome assembly tools for third-generation PacBio long-read sequence data

總結(jié)

以上是生活随笔為你收集整理的三代组装软件miniasm笔记的全部內(nèi)容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問題。

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