氨酰胺酶(glutaminase, GLS) 活性測定試劑盒說明書

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????????????????????????????????????????????????????????????????分光光度法?50管/48樣

注????意：?正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義：

GLS（EC?3.5.1.1）是酰胺基水解酶，催化天冬酰胺水解成谷氨酸和氨，在氮素代謝中具有重要調控作用，尤其是調節游離氨含量和尿素代謝。

測定原理：

GLS催化谷氨酰胺水解成L-谷氨酸和氨，利用奈氏試劑檢測氨增加的速率，即可計算其酶活性。

需自備儀器和用品：

臺式離心機、可見分光光度計、水浴鍋、1mL玻璃比色皿、可調式移液槍、研缽、冰和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一×1瓶，60 mL，4 ℃保存；

試劑二×1瓶，20 mL，4 ℃保存；

試劑三×1瓶，30 mL，常溫保存；

試劑四×1瓶，10 mL，常溫保存；

試劑五×1瓶，6 mL，常溫保存；

試劑六×1瓶，6 mL，常溫避光保存。

粗酶液提取：

1、細菌、細胞或組織樣品的制備：

細菌或培養細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（104個）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL試劑一），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；

8000g4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）樣品：直接檢測。

網址：lmbio.com.cn ?

?微信：Kimmy520xy

電話：13585802892

測定步驟：

1、分光光度計預熱30min以上，調節波長至420nm，蒸餾水調零。

2、樣品測定（在EP中加入下列試劑）：

試劑名稱（uL）	測定管	對照管
樣本	25
蒸餾水		25
試劑一	100	100
試劑二	400	400

混勻，37℃水浴1 小時

試劑三

525

525

混勻，8000 g，25℃離心10 min；取上清液，在EP管中加入下列試劑

上清液	650	650
試劑四	150	150
試劑五	100	100
試劑六	100	100

混勻，室溫靜置15min，420nm處讀取吸光值A，計算ΔA=A測定管-A對照管。對照管只要做一管。

注意：

1、試劑六如出現沉淀，靜置后取上清使用。

2、ΔA（A測定管-A對照管）若出現負值，可能是酶活性較低，可將反應時間1h延長到2h，相應的在計算公式中除以2。

酶活性計算：

標準條件下測定的回歸方程為y =3.8488x +0.0057，R2?= 0.9983；；x為標準品濃度（μmol/mL），y為吸光值A。

1、血清（漿）GLS活性

單位定義：每mL血清（漿）每min催化谷氨酰胺生成1nmol 氨定義為一個酶活力單位。GLS（nmol /min /mL）＝?(ΔA-0.0057) ÷3.8488×V反總÷V樣÷T×1000=181.8×(ΔA?-0.0057)

?2、組織、細菌或細胞GLS活性

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位定義：每mg蛋白質每min催化谷氨酰胺生成1nmol 氨定義為一個酶活力單位。

GLS（nmol /min /mg prot）＝?(ΔA-0.0057) ÷3.8488×V反總÷(V樣×Cpr)÷T×1000=181.8×(ΔA?-0.0057)÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位定義：每g組織每min催化谷氨酰胺生成1nmol 氨定義為一個酶活力單位。

GLS（nmol/min/g 鮮重）＝(ΔA-0.0057)÷3.8488×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷T×1000

=181.8×(ΔA -0.0057)÷W

（3）按細菌或細胞密度計算

單位定義：每1萬個細菌或細胞每min催化谷氨酰胺生成1nmol 氨定義為一個酶活力單位。GLS（nmol/min/104?cell）＝(ΔA-0.0057) ÷3.8488×V反總÷(500× V樣÷V樣總)÷T×1000

=0.3637×(ΔA-0.0057)

V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，60min；V反總：反應體系總體積，1.05mL；V樣：加入反應體系中樣本體積，0.025mL；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數，500萬; 1000，μmol到nmol換算系數。

總結

以上是生活随笔為你收集整理的氨酰胺酶(glutaminase, GLS) 活性测定试剂盒说明书的全部內容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問題。

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