1、冷凍管應(yīng)如何解凍？
取出冷凍管后，須立即放入 37 ℃水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在 1 分鐘內(nèi)全部融化，并注意水面不可超過冷凍管蓋沿，否則易發(fā)生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時(shí)，必須注意安全，預(yù)防冷凍管之爆裂。
2、細(xì)胞冷凍管解凍培養(yǎng)時(shí)，是否應(yīng)馬上去除 DMSO？
除少數(shù)特別注明對 DMSO 敏感的細(xì)胞外，絕大部分細(xì)胞株（包括懸浮性細(xì)胞），在解凍之后，應(yīng)直接放入含有 10-15ml 新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)角瓶中，待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除 DMSO 即可，如此可避免大部分解凍后細(xì)胞無法生長或貼附之問題。
3、可否使用與原先培養(yǎng)條件不同的培養(yǎng)基？
不能。每一細(xì)胞株均有其特定使用且已適應(yīng)之細(xì)胞培養(yǎng)基，若驟然使用和原先提供之培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基，細(xì)胞大都無法立即適應(yīng)，造成細(xì)胞無法存活。
4、可否使用與原先培養(yǎng)條件不同的血清種類？
不能。血清是細(xì)胞培養(yǎng)上一個(gè)極為重要的營養(yǎng)來源，所以血清的種類和品質(zhì)對于細(xì)胞的生長會產(chǎn)生極大的影響。來自不同物種的血清，在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同，血清使用錯(cuò)誤常會造成細(xì)胞無法存活。

5、何謂 FBS,FCS,CS,HS ?

FBS(fetal bovine serum)和 FCS(fetal calf serum)是相同的意思，兩者都是指*胎牛血清*，FCS 乃錯(cuò)誤的使用字眼，請不要再使用。CS (calf serum)則是指*小牛血清*。HS(horseserum)則是指*馬血清*。

6、培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)使用 百分之五 或 百分之十的CO2？或根本沒有影響？
一般培養(yǎng)基中大都使用 HCO3-/CO32-/H+作為 pH 的緩沖系統(tǒng)，而培養(yǎng)基中NaHCO3 的含量將決定細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用的 CO2 濃度。當(dāng)培養(yǎng)基中 NaHCO3 含量為每公升 3.7g 時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用百分之十的CO2；當(dāng)培養(yǎng)基中 NaHCO3 為每公升 1.5 g 時(shí)，則應(yīng)使用百分之五 的CO2 培養(yǎng)細(xì)胞。
7、何時(shí)須更換培養(yǎng)基？
視細(xì)胞生長密度而定，或遵照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上之更換時(shí)間，按時(shí)更換培養(yǎng)基即可。
8、培養(yǎng)基中是否須添加抗生素？
除于特殊篩選系統(tǒng)中外，一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下，培養(yǎng)基中不應(yīng)添加任何抗生素。
9、附著性細(xì)胞繼代時(shí)所使用的 trypsin-EDTA 濃度？應(yīng)如何處理？
一般使用之 trypsin-EDTA 濃度為 0.05百分之五 trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。第一次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中，保存于*–20 ℃*，避免反復(fù)冷凍解凍造成 trypsin 之活性降低，并可減少污染之機(jī)會。

10、懸浮性細(xì)胞應(yīng)如何繼代處理？

一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)角瓶中，*稀釋細(xì)胞濃度*即可，若培養(yǎng)液太多時(shí)，可將培養(yǎng)角瓶口端稍微抬高，直到無法容納為止。分瓶時(shí)取出一部份含細(xì)胞之培養(yǎng)液至另一新的培養(yǎng)角瓶，加入新鮮培養(yǎng)基稀釋至適當(dāng)濃度，重復(fù)前述步驟即可。

11、欲將一般動(dòng)物細(xì)胞離心下來，其離心速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速？
欲回收動(dòng)物細(xì)胞，其離心速率一般為 300xg (約 1,000rpm)，5-10 分鐘，過高之轉(zhuǎn)速，將造成細(xì)胞死亡。
12、細(xì)胞的接種密度為何？
依照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上之接種密度或稀釋分盤之比例接種即可。細(xì)胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細(xì)胞無法生長之一重要原因。
13、細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基的成份為何？
動(dòng)物細(xì)胞冷凍保存時(shí)最常使用的冷凍培養(yǎng)基是含 5-10% DMSO (dimethyl sulfoxide)和 90-95% 原來細(xì)胞生長用的新鮮培養(yǎng)基均勻混合。注意：由于 DMSO 稀釋時(shí)會放出大量熱能，故不可將 DMSO 直接加入細(xì)胞液中，必須使用前先行配制完成。
14、DMSO等級和無菌過濾之方式為何？
冷凍保存使用的DMSO 等級，必須為 Tissue culture grade 的DMSO (如Sigma D2650)，其本身即為無菌狀況，第一次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中，保存于 4°C，避免反復(fù)冷凍解凍造成 DMSO 之裂解而釋出有害物質(zhì)，并可減少污染之機(jī)會。若要過濾 DMSO，則須使用耐 DMSO 的 Nylon 材質(zhì)濾膜。
15、冷凍保存細(xì)胞之方法？
冷凍保存方法一:冷凍管置于 4℃30-60 分鐘→(-20℃30 分鐘*)→-80℃ 16-18 小時(shí)(或隔夜)→液氮槽 vaporphase 長期儲存。
冷凍保存方法二:冷凍管置于已設(shè)定程序的可程序降溫機(jī)中每分鐘降 1-3℃ 至–80℃以下，再放入液氮槽 vapor phase 長期儲存。
20℃不可超過 1 小時(shí)， 以防止冰晶過大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入*-80℃* 冰箱中， 惟存活率稍微降低一些。

15、細(xì)胞欲冷凍保存時(shí)，細(xì)胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細(xì)胞濃度？

冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為 *1x10^6*cells/ml vial，融合瘤細(xì)胞則以 *5x106* cells/ml vial 為宜。

16、應(yīng)如何避免細(xì)胞污染？
細(xì)胞污染的種類可分成細(xì)菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉?jié){菌。主要的污染原因?yàn)闊o菌操作技術(shù)不當(dāng)、操作室環(huán)境不佳、污染之血清和污染之細(xì)胞等。嚴(yán)格之無菌操作技術(shù)、清潔的環(huán)境、與品質(zhì)良好之細(xì)胞來源和培養(yǎng)基配制是減低污染之最好方法。
17、如果細(xì)胞發(fā)生微生物污染時(shí)，應(yīng)如何處理？
加入相應(yīng)抗生素。直接滅菌后丟棄之。
18、支原體(mycoplasma)污染的細(xì)胞，是否能以肉眼觀察出異狀？
不能。除極有經(jīng)驗(yàn)之專家外，大多數(shù)遭受支原體污染的細(xì)胞株，無法以其外觀分辨之。
19、支原體污染會對細(xì)胞培養(yǎng)有何影響？
支原體污染幾乎可影響所有細(xì)胞之生長參數(shù)，代謝及研究之任一數(shù)據(jù)。故進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前，必須確認(rèn)細(xì)胞為 mycoplasma-free，實(shí)驗(yàn)結(jié)果之?dāng)?shù)據(jù)方有意義。

20、CO2 培養(yǎng)箱的水盤如何保持清潔？

定期(至少*每兩周一次*) 以*無菌蒸餾水或無菌去離子水更換*之。

21、為何培養(yǎng)基保存于 4℃冰箱中，顏色會偏暗紅色，且 pH 值會越來越偏堿性？
培養(yǎng)基保存于 4℃冰箱中，培養(yǎng)基內(nèi)之 CO2 會逐漸溢出，造成培養(yǎng)基越來越偏堿性。而培養(yǎng)基中之酸堿指示劑(通常為 phenol red)的顏色也會隨堿性增加而更偏暗紅。培養(yǎng)基偏堿之結(jié)果，將造成細(xì)胞生長停滯或死亡。若培養(yǎng)基偏堿時(shí)， 可以通入無菌過濾之 CO2，以調(diào)整 pH 值。
22、各種細(xì)胞培養(yǎng)用的 dish，flask 是否均相同？
不同廠牌的 dish 或 flask，其所 coating 的 polymer 不同，制造程序亦不同，雖對大部分細(xì)胞沒有太大之影響，惟少數(shù)細(xì)胞則可能因使用廠牌不同之 dish 或 flask 而有顯著之生長差異。
23、購買的細(xì)胞冷凍管經(jīng)解凍后，為何會發(fā)生細(xì)胞數(shù)目太少的情形？購買的細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活率不佳可能原因？
研究人員在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)存活率不佳，常見原因可歸納為：培養(yǎng)基使用錯(cuò)誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳。血清使用錯(cuò)誤或血清的品質(zhì)不佳。解凍過程錯(cuò)誤。冷凍細(xì)胞解凍后，加以洗滌細(xì)胞和離心。懸浮細(xì)胞誤認(rèn)為死細(xì)胞。培養(yǎng)溫度使用錯(cuò)誤。細(xì)胞置于–80℃太久。
24、收到之冷凍管瓶身破裂，瓶蓋有裂紋，或瓶蓋脫落之原因？
冷凍管瓶蓋裂紋，或瓶身破裂，可能是因?yàn)椴僮髡邐A取冷凍管時(shí)用力不當(dāng)， 造成冷凍管裂損，建議使用止血鉗小心夾取。另冷凍管瓶蓋松動(dòng)或松脫，乃因熱脹冷縮之物理現(xiàn)象，冷凍管有可能因此而造成細(xì)胞污染，故冷凍管于放入和取出液氮桶時(shí)，均應(yīng)立刻將冷凍管再一次扭緊 。

25、如何選用特殊細(xì)胞系培養(yǎng)基？

培養(yǎng)某一類型細(xì)胞沒有固定的培養(yǎng)條件。在 MEM 中培養(yǎng)的細(xì)胞，很可能在DMEM 或 M199 中同樣很容易生長。總之，*首選 MEM 做粘附細(xì)胞培養(yǎng)、RPMI-1640 做懸浮細(xì)胞培養(yǎng)是一個(gè)好的開始*，各種目的無血清培養(yǎng)最好*首選 AIM V（12005） 培養(yǎng)基（SFM）*。

26、L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)中重要嗎？它在溶液中不穩(wěn)定嗎？
L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)是重要的。脫掉氨基后，L-谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過一段時(shí)間后會降解，但是確切的降解率一直沒有最終定論。L-谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成，而氨對于一些細(xì)胞具有毒性。
27、GlutaMAX-I 是什么？培養(yǎng)細(xì)胞如何利用 GlutaMAX-I？這個(gè)二肽有多穩(wěn)定？
GlutaMAX-I 二肽是一個(gè) L-谷氨酰胺的衍生物，其不穩(wěn)定的 alpha-氨基用 L-丙氨酸來保護(hù)。一種肽酶逐漸裂解二肽，釋放 L-谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-I 二肽非常穩(wěn)定，即使在 121 攝氏度滅菌 20 分鐘，GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解，如果在相同條件下，L-谷氨酰胺幾乎完全降解。
28、什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅？
酚紅在培養(yǎng)基中被用來作為 PH 值的指示劑：中性時(shí)為紅色，酸性時(shí)為黃色， 堿性時(shí)為紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用，（特別是雌激素）。為避免固醇類反應(yīng)，培養(yǎng)細(xì)胞，尤其是哺乳類細(xì)胞時(shí)，用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測，一些研究人員在做流式細(xì)胞檢測時(shí)，不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。
29、培養(yǎng)基中丙酮酸鈉的作用是什么？
丙酮酸鈉可以作為細(xì)胞培養(yǎng)中的替代碳源，盡管細(xì)胞更傾向于以葡萄糖作為碳源，但是，如果沒有葡萄糖的話，細(xì)胞也可以代謝丙酮酸鈉。

30、二價(jià)離子抑制胰蛋白酶活性嗎？使用胰蛋白酶時(shí)加入 EDTA 的目的是什么？

二價(jià)離子的確*抑制胰蛋白酶活性*。EDTA 用來螯合游離的鎂離子和鈣離子，以便保持*抑制胰蛋白酶的活性*。建議胰蛋白酶處理細(xì)胞前，用 EDTA 清洗細(xì)胞， 以*消除*來自培養(yǎng)基中所有的*二價(jià)離子*。

31、Hank‘s 平衡鹽溶液(HBS)要在空氣中使用，不需要 CO2 培養(yǎng)箱，原因是什么？Hank’s 平衡鹽溶液(HBS)和 Earle‘s 平衡鹽溶液(EBS)有什么本質(zhì)的功能差別？
HBS 和 EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平,在 Eagles(2.2g/L)中比在Hanks(0.35g/L)中高。碳酸氫鈉需用高水平的 CO2 平衡，以維持溶液的 PH 值。Eagles 液在空氣水平的 CO2 中，溶液會變堿，Hanks 液在 CO2 培養(yǎng)箱中會變酸。如果希望在 CO2 培養(yǎng)箱中保存組織，需要用 Eagles 液。如果僅僅是清洗將要在細(xì)胞培養(yǎng)基中儲存的組織，用 Hanks 液就可以了。

總結(jié)

以上是生活随笔為你收集整理的细胞培养常见问题分析的全部內(nèi)容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問題。

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