商 瑜，張啟明，李 悅，王瑩冰 （北京師范大學 生命科學學院，北京 １００８７５）

摘 要：

隨著生物醫藥產業和生命科學基礎研究對動物細胞培養規模、效率和安全性能要求的不斷 擴大和提高，無血清培養基的研制和開發已經成為細胞工程領域的重要課題。無血清培養基的發 展歷經了無血清來源、無動物源、無蛋白和化學成分限定培養基等四個階段，逐步使得無血清培養 基的成分更為明確和簡單，進一步提升了無血清培養基在細胞培養中可避免外源物污染等的優勢， 使其在生物制品和生命科學領域獲得了廣泛的應用和發展。本文主要系統總結了無血清培養基的 發展歷程、組分構成和優化方法，尤其對無血清培養基近年來在生物制品、干細胞培養及腫瘤研究 等方面的最新開發應用進行了扼要分析述論，以期對無血清培養基在生物學前沿領域的應用和優 化提供可借鑒的方向，尤其在腫瘤干細胞的方面可以進行更深入的探索。

關鍵詞：無血清培養基；生物制品；細胞培養 中圖分類號：Ｑ８１ 文獻標志碼：Ａ

　動物細胞培養技術近年來發展迅速，已經成為 生物工程領域中的前沿研究課題之一。其在生物制 品的生產、腫瘤細胞的體外建模、病毒的分離鑒定和 機體發育功能研究等方面均有重要應用。通常，為 了提供細胞生長所需的激素、生長因子等物質，動物 細胞是在含血清的培養基中進行培養的。但血清成 分復雜且不完全明確，批次間容易產生較大差異，培 養中易發生外源物污染，并且血清本身價格也比較昂貴等；這些均使得血清在生產和研究中的應用存 在諸多不利。目前，已有大量實驗數據證實無血清 培養基不僅能避免或改善含血清培養基所帶來的上 述缺陷，也能獲得良好的培養效果并維持原有生物 學功能［１］。歐洲替代方法研究中心科學咨詢委員會 （Ｔｈｅ ＥＣＶＡＭ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｄｖｉｓｏｒｙ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ， ＥＳＡＣ）和歐 洲 體 外 毒 理 學 會（ＥｕｒｏｐｅａｎＳｏｃｉｅｔｙｏｆ ＴｏｘｉｃｏｌｏｇｙＩｎｖｉｔｒｏ，ＥＳＴＦＶ）等多個機構組織均發 表聲明，強烈建議減少細胞體外培養過程中血清等 動物源性物質的添加，盡可能在現有細胞培養領域 使用無血清培養基［２］。由此可見，無血清細 胞 培 養 技術的研究日益受到人們的關注，并逐漸成為當今 動物細胞體外培養領域的主流與趨勢。

無血清培養基的發展歷程 無血清培養基是在合成培養基的基礎上發展起 來的，與傳統的培養基相比，既能滿足細胞在體外長 時間培養的要求，又能避免動物血清所帶來的不利 因素。無血清培養基的發展歷程一般分為無血清培 養基、無動物源培養其、無蛋白培養基及化學成分限 定培養基等四類［３］。

１．１ 無血清培養基（Ｓｅｒｕｍ－ＦｒｅｅＭｅｄｉｕｍ，ＳＦＭ）

無血清培養基，即為不添加動物血清。但 是 為 了滿足細胞的生長，會添加替代血清功能的生物材 料，如轉鐵蛋白、胰島素和動植物的提取物等。這使 得此類培養基中含大量動植物來源蛋白，添加物質 的化學成分也不夠明確［４］。因此，會對后續 處 理 應 用造成部分不利影響（如目標蛋白的分離純化），同 時成本也較高。由于人們可以就實際需求對其進行 相對簡單的成分改進，使得其應用仍較為廣泛。

１．２ 無動物源培養基（ＡｎｉｍａｌＣｏｍｐｏｎｅｎｔＦｒｅｅ Ｍｅｄｉｕｍ，ＡＣＦＭ） 此類培養基采用蛋白水解物、重組蛋白或其他 化學物質來取代動物源蛋白。它既可以滿足細胞生 長及增殖的需要，還能夠降低培養基的生產成本，提 高重組蛋白類藥物安全性［５］。目前主要應用于生物 藥品的研發和生產中。

１．３ 無蛋白培養基（Ｐｒｏｔｅｉｎ－ＦｒｅｅＭｅｄｉｕｍ，ＰＦＭ） 該 類 培 養 基 完 全 不 含 有 血 清 和 動 物 來 源 的 蛋 白，但仍包含來源于植物蛋白的水解物或合成多肽 片段等其他衍生物。由于所含蛋白極低，并且蛋白 成分明確，有 利 于 重 組 蛋 白 的 下 游 生 產、分 離 和 純 化，總體成本也會大幅 下 降［６－７］。但 其 通 用 性 較 差， 需要針對目標細胞株進行特異性的優化［８］。目前主 要應 用 于 生 命 科 學 研 究 和 基 因 工 程 藥 物 開 發 等 領域。

１．４ 化學成分限定培養基（ＣｈｅｍｉｃａｌｌｙＤｅｆｉｎｅｄ Ｍｅｄｉｕｍ，ＣＤＭ） 此類培養 基 完 全 無 血 清、無 蛋 白，成 分 完 全 明 確，可以保證培養基批次間的一致性。它既有利于 跟蹤細胞培養的代謝情況，在后續的分離純化中也 非常方便，是目前最為安全和理想的培養基。可是 并非所有的細胞都能在化學限定培養基中達到較高 的表達水平，需要不斷改進設計方案和配方［９］。 ２ 無血清培養基的組分構成和 設計優化

２．１ 無血清培養基的組分構成 無血清培養基一般由基礎培養基和替代血清的 補充因子兩部分組成。基礎培養基通常是按一定比 例的葡萄糖、氨基酸、無機鹽和維生素等組合而成的 合成培養基，它是維持組織或細胞生長代謝必不可 少的物質。而補充因子，替代了傳統培養基中的血 清，既能有效避免血清帶來的諸多問題，也能滿足動 物細胞培養的要求。補充因子根據需求的必要性一 般分為必需補充因子和特殊補充因子。必需補充因 子是所有細胞株在無血清培養基中生長時都需要 的，包括胰島素和轉鐵蛋白等。特殊補充因子一般 含有激素、生長因子微量元素、貼壁和鋪展因子、維 生素和酶抑制劑等。

２．２ 無血清培養基的設計優化 在無血清培養基的具體應用中，可以通過選擇 或優化適當的基礎培養基和補充因子的種類及用 量，使其更符合培養要求。例如，細胞工程的常用細 胞 ＣＨＯ 往 往 是 利 用 ＤＭＥＭ ∶Ｆ１２∶ＲＰＭＩ１６４０ （２∶１∶１）［１０］或者 ＥＸ－ＣＥＬＬＴＭ３０２［１１］作為基礎培 養 基，而 Ｖｅｒｏ 的 常 用 基 礎 培 養 基 則 為 Ｍ１９９、 ＤＭＥＭ 或Ｆ１２等。對于補充因子，更是不斷嘗試優 化開發新的替代品。如必需補充因子中的胰島素， 因其費用昂貴，目前有研究報道可利用金精三羧酸 （ＡｕｒｉｎＴｒｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃＡｃｉｄ，ＡＴＡ）作為胰島素替代 物培養 ＣＨＯ 細胞，細胞的生長正常，并極大降低了 成本［１１］。轉鐵蛋白是細胞無血清培養最重要的補 充因子之一，它的缺失會抑制細胞的生長，同時它也 是一些有害微量 元 素 的 螯 合 劑。Ｒｏｕｒｏｕ等 在 研 究 Ｖｅｒｏ細胞無血清培養基時認為，維生素 Ｃ和檸檬酸 鐵混合使用可以替代轉鐵蛋白，這為尋求轉鐵蛋白 替代品提供了參考［１２］。

通常，為了更好地達到無血清培養基組分優化 開發，研究人員可采用培養過程分析法、分子生物技 術法和統計學設計法等方法進行系統分析，進而獲 得滿足目標細胞生長要求的無血清培養基［１３］。

２．２．１ 培養過程分析法 培養過程分析法是以動 態的細胞代謝為基礎，通過對細胞培養過程中各培 養基的組分進行實時監測，了解細胞的生理狀態變 化，根據需求調整培養基組分及補料策略的設計方 法。在細胞培養過程中，各培養組分必須維持在一 定水平。因此可以通過消耗組分分析法來對葡萄 糖、谷氨酰胺、維生素和氨基酸等組分進行設計；也 可以通過化學計量分析法，建立培養基各組分與細 胞能量代謝、生物量或蛋白合成量之間的化學計量 函數，從而對基礎培養基、補料培養基及補料策略進 行設計。

２．２．２ 分子生物技術法 分子生物技術法是以基 因組學和蛋白組學技術為依托的一種高通量的設計 方法。研究人員可以應用基因芯片、抗體芯片和雙 向凝膠電泳等技術，在 ｍＲＮＡ 和蛋白水平上獲得細 胞培養過程中關鍵基因或蛋白的變化情況，用以確 定培養基中調控這些基因或蛋白表達的成分的添加 類型和比例，進而調控細胞的生長、分化和凋亡等生 理指標［１４］。

２．２．３ 統計學實驗設計法 統計學實驗設計法是 通過在培養基的設計、優化及數據結果分析中運用 統計學方法，經濟地獲得可靠結果，并將誤差降到最 低的一種設計方法。由于其省時省力，具有快速獲 得大量參數的優勢，近年來被廣泛應用于細胞培養 及過程優化中，并取得了卓有成效的研究成果。如 ２０１０年Ｊｅｏｎ等人利用分式析因設計和響應面的統 計學方法對人 細 胞 毒 素 Ｔ 淋 巴 細 胞 無 血 清 培 養 基 中的卵磷脂、多 胺、抗氧化劑和膽固醇進行設計優 化，最終獲得最高活細胞密度比有血清培養基高１．５ 倍的無血清培養基，而且其 Ｔ 淋巴細胞效應功能仍 然保留［１５］。

無血清培養基的應用

３．１ 生物制品和生物藥物研制與生產方面的應用 目前，生產生物活性蛋白、疫苗、單克隆 抗 體 和 基因治療藥物的表達載體等生物制品時一般都采用 可高密度生長的動物工程細胞。無血清培養技術的 運用，給動物工程細胞提供了更優的生長條件，進而 表達更多的目的產物，并有利于后續目的產物的分 離和純化，顯 示 了 其 強 大 的 優 勢。Ｋｕｔｓｕｚａｗａ等 在 研究新的３Ｄ 培 養 系 統 時 發 現，無 血 清 培 養 基 較 有 血清培養基可提高大約３倍的重組蛋白產量，使該 系統能更好 地 適 用 于 生 物 制 藥 生 產［１６］。為 避 免 生 物制品的血清污染，Ｔｏｒｉｎｉｗａ等研究得到一種用無 血清培 養 基 生 產 Ｖｅｒｏ細 胞 源 乙 型 腦 炎 疫 苗 的 方 法，而且其疫苗可通過添加穩定劑（如山梨醇或甘氨 酸），實現在室溫下儲存［１７］。Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ 等 利 用 ＣＨＯ 細胞生產單克隆抗體時發現，在無血清條件下 培養，就無血清培養基的基礎培養基適應性進行了 對比評價，指出相比于 ＤＥＭＥ培養基，ＥＸ－ＣＥＬＬ培 養基更有利于單克隆抗體的生產，這為后續單抗的 研發生產奠定了良好的基礎［１８］。Ｋｕｒｏｄａ等在研發 慢病毒載體 生 產 方 法 時，開 發 了 培 養 人 胚 腎 ＨＥＫ ２９３細胞的無蛋白培養基，從而獲得了低成本、無批 次差異且高滴度的慢病毒載體［１９］。所以說，無血清 培養基清晰明確的成分以及完善的質控體系，使得 制備生物制品和生物藥物的宿主細胞，在培養過程 中更加穩定，產物表達效率更高，產品質量更加安全 可靠。

３．２ 干細胞培養和研究方面的應用 干細胞（ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ，ＳＣ）是一類具有自我復制 能力的多潛能細胞，在一定條件下，它可以分化成多 種功能細胞，因此對其培養條件的質量控制成為關 鍵。目前，鑒于無血清培養基擁有明確成分的特性， 它已被 廣 泛 應 用 于 干 細 胞 的 體 外 培 養 和 研 究 中。 Ｓｗａｍｙｎａｔｈａｎ等通過體外實驗驗證 ＭｅｓｅｎｃｕｌｔＴＭ間 充質干細胞無血清培養基相較有血清培養基，完全 可以為臍帶來源的間充質干細胞提供體外大規模培 養所需的營養條件；無血清培養基培養的干細胞保 留了臨床治療所需要的干細胞特性，并且減少了因 血清帶來的后續治療中的潛在危險［１］。另 一 方 面， 研究人員不斷開發新型無血清培養基，以提高培養 效率或者適用于不同誘導分化需求。Ｚｈａｎｇ等利用 含 有 ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＦＧＦ－１、ｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－ｌｉｋｅ ５ 和 ＩＧＦＢＰ２等五種因子的無血清培養基可以使人臍血 造血干細胞（ＨＳＣ）在 體 外 生 長 速 度 提 高２０倍，為 臨床應用提供培養條件上的支持［２０］。Ｐｉｃｋ等 則 開 發了一個無血清無滋養培養系統，他們利用該系統 成功從人胚胎干細胞分化獲得可產生血小板樣細胞 的骨髓巨核細胞，這使得人類朝干細胞誘導分化獲 得治療用人 類 血 小 板 又 邁 進 了 一 大 步［２１］。最 近 研 究報道，為了應對腸道組織天然干細胞來源不足的 問題，Ｍａｈｍｏｕｄ等開發出一種適宜腸道干細胞體 外增殖的無血清培養基，他們添加了乙醇胺、轉鐵蛋白、抗壞血酸磷酸鹽、亞硒酸鈉和谷胱甘肽等五種補 充因子［２２］。該成 果 對 于 基 礎 研 究 和 臨 床 應 用 均 具 有積極意義。

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總結

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