一、新冠病毒簡(jiǎn)介

? ? ?2019新型冠狀病毒（2019-nCoV，世衛(wèi)組織2020年1月命名；SARS-CoV-2，國(guó)際病毒分類委員會(huì)2020年2月11日命名）簡(jiǎn)稱“新冠”。

??????? 冠狀病毒是一個(gè)大型病毒家族，已知可引起感冒及中東呼吸綜合征（MERS）和嚴(yán)重急性呼吸綜合征（SARS）等較嚴(yán)重疾病。新型冠狀病毒是以前從未在人體中發(fā)現(xiàn)的冠狀病毒新毒株。

? ? ? 2021年1月15日，英國(guó)已發(fā)現(xiàn)了一種來(lái)自巴西的變種新冠病毒?。2月21日，據(jù)俄羅斯報(bào)道，在印度各地發(fā)現(xiàn)了多達(dá)240種新冠病毒毒株的新型變種?。3月30日，中國(guó)—世衛(wèi)組織新冠病毒溯源聯(lián)合研究報(bào)告在日內(nèi)瓦發(fā)布，報(bào)告顯示，武漢華南海鮮市場(chǎng)不是新冠病毒最初來(lái)源地。.......此處省略一萬(wàn)字，可自行百度。

二、新冠病毒檢測(cè)的本質(zhì)

? ? ?

? ? ? 核酸（DNA或者RNA）是生物體的遺傳物質(zhì)，具有較好的保守性、完整性和儲(chǔ)存遺傳信息的功能。因此可以通過(guò)檢測(cè)樣本的核酸來(lái)判斷是否有新冠。核酸我們大家都知道是由AGCT(或者AGCU)組成，每個(gè)位置有4種可能的堿基，可以是AGCT中的任何一位。假設(shè)一個(gè)物種有100個(gè)核酸堿基組成，那么至少有4的100次方的序列可能，這已經(jīng)是天文數(shù)字了。然而真實(shí)的新冠病毒有29763bp，如果隨機(jī)突變的話有4*29763次方的組合排列，每一種排列都可能產(chǎn)生一種新的序列信息，因此如果想要通過(guò)檢測(cè)核酸去針對(duì)的檢測(cè)相應(yīng)的新冠毒株是比較困難的。我們必須盡可能多的找到相應(yīng)毒株的核酸序列，從中找到相應(yīng)株中都存在的保守序列，同時(shí)在其他株中不出現(xiàn)，方能完成特異性檢測(cè)。

三、新冠病毒檢測(cè)技術(shù)——熒光定量PCR

? ? ? 實(shí)時(shí)熒光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測(cè)每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量,通過(guò)內(nèi)參或者外參法對(duì)待測(cè)樣品中的特定DNA序列進(jìn)行定量分析的方法。Real-timePCR是在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，通過(guò)熒光信號(hào)，對(duì)PCR進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)。由于在PCR擴(kuò)增的指數(shù)時(shí)期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系，所以成為定量的依據(jù),下圖為qpcr反應(yīng)及檢測(cè)過(guò)程示意圖:

? ? ?通常qpcr設(shè)計(jì)引物長(zhǎng)度在18-30bp之間，擴(kuò)增片段在75-250bp之間。qpcr過(guò)程擴(kuò)增產(chǎn)物短，擴(kuò)增特異性強(qiáng)、效率高，能極大擴(kuò)增病毒核酸信號(hào)，核酸檢測(cè)在新冠流行期間發(fā)揮了重要的防疫作用。

四、新冠變異株核酸序列準(zhǔn)備

? ? ? 第一步找到NCBI上的新冠數(shù)據(jù)庫(kù)：

? ? ? ?第二步篩選新冠變異株序列并下載：

新冠變異株	Alpha	Beta	Delta	Gamma	普通株
Pango lineage	B.1.1.7	B.1.351	P.1	B.1.617.2	-

? ? ? ? 通過(guò)Pango lineage號(hào)我們能迅速的找到新冠常見(jiàn)的四種變異株，為了我們后期的算法方便，也為了進(jìn)一步對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行高質(zhì)量過(guò)濾簡(jiǎn)化處理，我們可以通過(guò)下面三個(gè)參數(shù)進(jìn)行篩選:第一個(gè)為特殊符號(hào)，測(cè)序過(guò)程對(duì)于測(cè)序堿基不能確定的會(huì)以N表示，我們選擇特殊符號(hào)為0，那么表示本次篩選到的是高質(zhì)量的測(cè)序結(jié)果;第二個(gè)為基因組的完整度，我們選擇complete，表示完全匹配，測(cè)序深度很高，和參考基因組無(wú)縫拼接;第三個(gè)為Pango lineage，我們就不用多講了，想要哪個(gè)變異株就輸入哪個(gè)號(hào)。

? ? ? ?

?????? 下載后的新冠阿爾法毒株有上萬(wàn)條序列，每一條序列表示一個(gè)完整新冠基因組，總大小有1.9G的數(shù)據(jù)量。貝塔株較小有7.6M，德?tīng)査袑⒔?0M，伽馬有115M的數(shù)據(jù)量，這些數(shù)據(jù)量的處理最好需要適合生物信息學(xué)的高配置電腦去處理。

? ? ?

?五、設(shè)計(jì)原理分析

Alpha：α1，α2，α3，......αn

Beta：β1，β2，β3，......βn

Delta：δ1，δ2，δ3，......δn

Gamma：γ1，γ2，γ3，......γn

Normal：Alpha，Beta，Delta，Gamma 和其他株

? ? ? ?如上，下載后的序列中，包含NCBI上已經(jīng)審核提交的所有的完整的相應(yīng)株的序列。假如你要設(shè)計(jì)pcr的引物長(zhǎng)度為20bp，首先從Alpha開(kāi)始，你設(shè)計(jì)的5‘端和3’端引物必須同時(shí)出現(xiàn)在Alpha株中所有的其他序列中。有人會(huì)問(wèn)為什么同是阿爾法的病毒不同序列會(huì)不一樣，他們不都是阿爾法株嗎？也就是說(shuō)α1不完全等于α2，α2不完全等于α3，以此類推，有可能在所有的α中，沒(méi)有任何兩個(gè)是完全一樣的，理論上可能出現(xiàn)這種情況，正如同上面我們說(shuō)到的新冠檢測(cè)本質(zhì)一樣，其堿基基數(shù)太大，而SNP(也叫單核苷酸突變位點(diǎn))是很容易在培養(yǎng)的病毒或者流行的病毒中發(fā)現(xiàn)的。我們知道新冠為單鏈RNA病毒，單鏈相比于雙鏈更加容易發(fā)生堿基突變，但這并不妨礙變異株還是新冠病毒的事實(shí)，因?yàn)橹挥挟?dāng)突變到達(dá)一定的比例之后才能定義為新物種。言歸正傳，當(dāng)序列滿足同時(shí)出現(xiàn)在所有的阿爾法株時(shí)，還需要滿足其特異性檢測(cè)，也就是其引物一定不能出現(xiàn)在貝塔、德?tīng)査①ゑR中。對(duì)于貝塔、德?tīng)査①ゑR的引物設(shè)計(jì)如同阿爾法毒株引物設(shè)計(jì)思路。

? ? ? ?下一步就是如何實(shí)現(xiàn)上面的思路，qpcr擴(kuò)增的酶具有高保真性，也就是說(shuō)當(dāng)引物序列和待檢測(cè)的樣本核酸序列完全匹配時(shí)才能進(jìn)行擴(kuò)增。因此我們所涉及的序列是具有特異性、唯一性。我們借鑒宏基因組測(cè)序分析方法——kermer，通過(guò)20bp的kermer，我們可以將一條序列全部截成長(zhǎng)度為20bp的連續(xù)序列，如我們的序列長(zhǎng)度29763bp，則可以生產(chǎn)29763-20+1=29744條長(zhǎng)度為20bp的堿基集。

? ? ? ?好了，今天先講到這里，歡迎訂閱下期文章。順便再做下推廣：新的宏基因組在線分析網(wǎng)站地址為：www.xiaohongwgsa.top，感興趣的可以查看！歡迎掃碼定期訂閱相關(guān)文章！

?

總結(jié)

以上是生活随笔為你收集整理的【无标题】新冠病毒变异株检测——荧光定量PCR检测技术开发的全部?jī)?nèi)容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問(wèn)題。

如果覺(jué)得生活随笔網(wǎng)站內(nèi)容還不錯(cuò)，歡迎將生活随笔推薦給好友。