一、新冠病毒簡介

? ? ?2019新型冠狀病毒（2019-nCoV，世衛(wèi)組織2020年1月命名；SARS-CoV-2，國際病毒分類委員會2020年2月11日命名）簡稱“新冠”。

??????? 冠狀病毒是一個大型病毒家族，已知可引起感冒及中東呼吸綜合征（MERS）和嚴(yán)重急性呼吸綜合征（SARS）等較嚴(yán)重疾病。新型冠狀病毒是以前從未在人體中發(fā)現(xiàn)的冠狀病毒新毒株。

? ? ? 2021年1月15日，英國已發(fā)現(xiàn)了一種來自巴西的變種新冠病毒?。2月21日，據(jù)俄羅斯報道，在印度各地發(fā)現(xiàn)了多達(dá)240種新冠病毒毒株的新型變種?。3月30日，中國—世衛(wèi)組織新冠病毒溯源聯(lián)合研究報告在日內(nèi)瓦發(fā)布，報告顯示，武漢華南海鮮市場不是新冠病毒最初來源地。.......此處省略一萬字，可自行百度。

二、新冠病毒檢測的本質(zhì)

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? ? ? 核酸（DNA或者RNA）是生物體的遺傳物質(zhì)，具有較好的保守性、完整性和儲存遺傳信息的功能。因此可以通過檢測樣本的核酸來判斷是否有新冠。核酸我們大家都知道是由AGCT(或者AGCU)組成，每個位置有4種可能的堿基，可以是AGCT中的任何一位。假設(shè)一個物種有100個核酸堿基組成，那么至少有4的100次方的序列可能，這已經(jīng)是天文數(shù)字了。然而真實的新冠病毒有29763bp，如果隨機(jī)突變的話有4*29763次方的組合排列，每一種排列都可能產(chǎn)生一種新的序列信息，因此如果想要通過檢測核酸去針對的檢測相應(yīng)的新冠毒株是比較困難的。我們必須盡可能多的找到相應(yīng)毒株的核酸序列，從中找到相應(yīng)株中都存在的保守序列，同時在其他株中不出現(xiàn)，方能完成特異性檢測。

三、新冠病毒檢測技術(shù)——熒光定量PCR

? ? ? 實時熒光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量,通過內(nèi)參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進(jìn)行定量分析的方法。Real-timePCR是在PCR擴(kuò)增過程中，通過熒光信號，對PCR進(jìn)程進(jìn)行實時檢測。由于在PCR擴(kuò)增的指數(shù)時期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系，所以成為定量的依據(jù),下圖為qpcr反應(yīng)及檢測過程示意圖:

? ? ?通常qpcr設(shè)計引物長度在18-30bp之間，擴(kuò)增片段在75-250bp之間。qpcr過程擴(kuò)增產(chǎn)物短，擴(kuò)增特異性強(qiáng)、效率高，能極大擴(kuò)增病毒核酸信號，核酸檢測在新冠流行期間發(fā)揮了重要的防疫作用。

四、新冠變異株核酸序列準(zhǔn)備

? ? ? 第一步找到NCBI上的新冠數(shù)據(jù)庫：

? ? ? ?第二步篩選新冠變異株序列并下載：

新冠變異株	Alpha	Beta	Delta	Gamma	普通株
Pango lineage	B.1.1.7	B.1.351	P.1	B.1.617.2	-

? ? ? ? 通過Pango lineage號我們能迅速的找到新冠常見的四種變異株，為了我們后期的算法方便，也為了進(jìn)一步對數(shù)據(jù)進(jìn)行高質(zhì)量過濾簡化處理，我們可以通過下面三個參數(shù)進(jìn)行篩選:第一個為特殊符號，測序過程對于測序堿基不能確定的會以N表示，我們選擇特殊符號為0，那么表示本次篩選到的是高質(zhì)量的測序結(jié)果;第二個為基因組的完整度，我們選擇complete，表示完全匹配，測序深度很高，和參考基因組無縫拼接;第三個為Pango lineage，我們就不用多講了，想要哪個變異株就輸入哪個號。

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?????? 下載后的新冠阿爾法毒株有上萬條序列，每一條序列表示一個完整新冠基因組，總大小有1.9G的數(shù)據(jù)量。貝塔株較小有7.6M，德爾塔有將近70M，伽馬有115M的數(shù)據(jù)量，這些數(shù)據(jù)量的處理最好需要適合生物信息學(xué)的高配置電腦去處理。

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?五、設(shè)計原理分析

Alpha：α1，α2，α3，......αn

Beta：β1，β2，β3，......βn

Delta：δ1，δ2，δ3，......δn

Gamma：γ1，γ2，γ3，......γn

Normal：Alpha，Beta，Delta，Gamma 和其他株

? ? ? ?如上，下載后的序列中，包含NCBI上已經(jīng)審核提交的所有的完整的相應(yīng)株的序列。假如你要設(shè)計pcr的引物長度為20bp，首先從Alpha開始，你設(shè)計的5‘端和3’端引物必須同時出現(xiàn)在Alpha株中所有的其他序列中。有人會問為什么同是阿爾法的病毒不同序列會不一樣，他們不都是阿爾法株嗎？也就是說α1不完全等于α2，α2不完全等于α3，以此類推，有可能在所有的α中，沒有任何兩個是完全一樣的，理論上可能出現(xiàn)這種情況，正如同上面我們說到的新冠檢測本質(zhì)一樣，其堿基基數(shù)太大，而SNP(也叫單核苷酸突變位點)是很容易在培養(yǎng)的病毒或者流行的病毒中發(fā)現(xiàn)的。我們知道新冠為單鏈RNA病毒，單鏈相比于雙鏈更加容易發(fā)生堿基突變，但這并不妨礙變異株還是新冠病毒的事實，因為只有當(dāng)突變到達(dá)一定的比例之后才能定義為新物種。言歸正傳，當(dāng)序列滿足同時出現(xiàn)在所有的阿爾法株時，還需要滿足其特異性檢測，也就是其引物一定不能出現(xiàn)在貝塔、德爾塔、伽馬中。對于貝塔、德爾塔、伽馬的引物設(shè)計如同阿爾法毒株引物設(shè)計思路。

? ? ? ?下一步就是如何實現(xiàn)上面的思路，qpcr擴(kuò)增的酶具有高保真性，也就是說當(dāng)引物序列和待檢測的樣本核酸序列完全匹配時才能進(jìn)行擴(kuò)增。因此我們所涉及的序列是具有特異性、唯一性。我們借鑒宏基因組測序分析方法——kermer，通過20bp的kermer，我們可以將一條序列全部截成長度為20bp的連續(xù)序列，如我們的序列長度29763bp，則可以生產(chǎn)29763-20+1=29744條長度為20bp的堿基集。

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總結(jié)

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