植物组织培养过程中的常见难点及解决
玻璃苗、褐化和污染是組培的3大難點。下面小編與您分享一下常見的處理方法。
1
玻璃化現象
在進植物組織培養時，經常會發現試管苗呈半透明狀，植株矮小腫脹、失綠；葉片皺縮或卷曲、脆弱破碎；葉表無角質層蠟質，沒有功能性氣孔，僅有海綿組織，沒有柵欄組織。這種試管苗生長異?，F象被稱為“玻璃化”，是植物組織培養中特有的一種生理性病變，是培養環境中的一些物理、化學和生化因子共同作用使植物組織新陳代謝紊亂所造成的。玻璃苗的光合能和酶活性低，器官功能不全，分化能力低，很難繼續用作繼代培養和擴大繁殖的材料。
1.1 玻璃苗發生的因素
培養材料種類和外植體類型影響玻璃苗的發生：梅菜外植體玻璃苗發生率依次是下胚軸≥莖尖≥子葉。瑞香基部莖段玻璃苗的發生率最低，其次是莖尖，中部莖段產生的玻璃苗幾率最高。此外，玻璃化還可能與外植體大小有關。組培苗生長的微環境能夠影響玻璃化的發生有研究表明，光照時間太長會導致玻璃化現象的增加，超過１４ｈ玻璃化現象較嚴重。使用透氣性較差的塑口薄膜封口或組培溫度過高時，由于引起組培瓶內氣體組成的改變，也提高了玻璃化率。
培養基成分（如大量元素、植物激素和蔗糖濃度等）與玻璃化現象有關：培養基中的ＮＨ４＋過多容易導致試管苗玻璃化的發生。在ＢＡ質量濃度０、５～１．０ｍｇ／Ｌ條件下，玻璃苗率隨ＢＡ濃度的增加而顯著上升。蔗糖濃度與玻璃化呈負相關，在一定范圍內，蔗糖濃度越高，玻璃苗的比率越低。
1.2 措施：
①增加組培室內通氣， 并改善培養容器的通風換氣條件， 適當 縮短繼代間隔時間。許多研究表明 ，使用透氣性好的容器或封口材 （如牛皮紙和棉塞）可顯著降低玻璃苗率 。
增加自然光照
②組培室溫度：組培室溫度控制在２０ ～２５ ℃，可緩解玻璃化現象。另外， 采用晝夜變溫交替取代恒溫也是錯的選擇?！?/p>
③適當提高培養基中蔗糖含在培養基中添加４％和３.５％的蔗糖，能分別較好地預防光葉楮和山桐子組培玻璃苗的發生 ?！?/p>
④調節培養基中植物生長調節劑的濃度和比例
2
褐變
2.1 影響褐變的因素
植物種類、基因型及外植體類型：橡膠樹不同品種或品系的褐變程度不同，海墾２號的花藥褐變較少，而有些品種極褐變。除了木本植物，豆科植物和蕓苔屬植物原生質體培養中也普遍存在著褐化問題。甜菜品系的染色體倍數性、無菌苗的苗齡、外植體部位等因素對甜菜組織培養過程中外植體褐變均有影響。在辣椒的組織培養中，下胚軸分生能較強，其外植體生長旺盛，褐變程度低于子葉。
培養條件光照過強或光照時間超過１６ｈ的外植體很快褐變¨。溫度過高也能促進培養物的褐變。ＣＯ濃度過高引發細胞內積累過多的ＣＯ；并與細胞膜上ｃａ結合而使有效ｃａ減少，導致內膜系統紊亂和瓦解，致使褐變發生。培養基ｐＨ值適宜也是某些植物種類產生褐變的原因之一。
培養基成分對一般桉樹來說，大元素和外源激素的濃度增大會造成褐化程度的加重。激素使用不當時，外植體也容易褐變。ＮＡＡ濃度超過０．２ｍｇ／Ｌ時，褐變率明顯增高。
外植體消毒一般消毒時間越長，褐化率越高。
2.2 克服褐變的方法：
選擇適當的外植體處于旺盛時期的外植體，具有較強的分裂能，其褐變程度低。因此，最好選用實生幼苗和早春的材作為外植體。取材時，還應根據植物種類選擇適宜的基因型和部位。
進行材料的預處理：外植體經流水沖洗后，放在２～５℃的低溫下處理１２～２４ｈ，再用升汞或７０％酒精消毒，然后接種于只含有蔗糖的瓊脂培養基中培養５～７ｄ，使組織中的酚類物質部分滲入培養基中。取出外植體用０、１％漂白粉溶液浸泡１０ｍｉｎ，再接種到合適的培養基中，如果仍有酚類物質滲出，接種后１～２ｄ立即轉移到新鮮培養基中或同一瓶培養基的同部位，這樣連續轉移５～６次可基本解決外植體的褐變問題。
選擇適宜的培養基和培養條件調節光照和溫度、改善通風、調節培養基的ｐＨ值，均能夠緩解外植體褐變。使用靜態培養和固體培養交替進，使外植體在液體培養基上將傷口愈合后，再轉至固體培養基上培養，也能減輕褐變。
添加合適的褐變抑制劑和吸附劑比較有效的褐變抑制劑有水解乳蛋白（ＬＨ）、乙二胺四乙酸（ＥＤ—ＴＡ）、血清白蛋白、檸檬酸和硫代硫酸鈉（ＮａＳＯ）等。常用的吸附劑有聚乙烯吡咯烷酮（ＰＶＰ）和活性炭，但使用時應注意選擇適宜的濃度，否則培養基中的營養成分也會被吸附。
3
污染
3.1 污染原因
造成污染的原因很多，如工作環境空氣不清潔，超凈工作臺過濾裝置失效，培養基及器皿滅菌徹底，外植體帶菌及操作違規等。造成污染的病原主要為細菌真菌和內源菌。細菌性污染的主要癥狀是培養材附近出現粘液狀和發酵泡沫狀物體，或在材附近的培養基中出現混濁和云霧狀痕跡。細菌性污染除外植體帶菌或培養基滅菌徹底外，主要是操作人員的慎造成的。真菌污染表現在培養基上產生灰褐色、暗綠色或白色等菌，嚴重時可導致組培苗出現病狀，甚至導致苗腐爛、死亡。真菌污染除直接接觸傳播外，主要通過空氣媒介傳播。對外植體帶菌引起的污染，情況則比較復雜，與外植體的種類、取材季節、部位、預處方法及消毒方法等密切相關。
3.2 污染防治
①保持組織培養室和接種室的潔凈。操作人員應定期用８４滅菌和酒精噴霧。注意除塵，定時用紫外燈消毒。
END
賽思基因長期從事植物組織培養和體細胞再生研究，擁有多項專利技術可有效避免組織培養中的三大難題。目前已開發了國內首個的茶樹、藜麥、甘藍、抱子甘藍、白菜等特殊物種的遺傳轉化體系，期待與您共同探尋基因的功能。
關注我們了解更多
賽思基因（www.scientsgene.com），專注遺傳轉化技術的應用于開發，致力于打破基因型限制，助力基因編輯育種。
總結
以上是生活随笔為你收集整理的植物组织培养过程中的常见难点及解决的全部內容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問題。
