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參考：產(chǎn)品手冊

PacBio三代全長轉(zhuǎn)錄組有什么優(yōu)勢？

近年來，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組測序已經(jīng)成為研究基因表達(dá)調(diào)控的主要手段。但二代的轉(zhuǎn)錄本重構(gòu)準(zhǔn)確率很低，三代可以直接得到全長轉(zhuǎn)錄本，無需組裝。可改善基因表達(dá)定量結(jié)果，發(fā)現(xiàn)新的基因和轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體，鑒定可變剪切及基因融合現(xiàn)象。

Google第一個(gè)就是官網(wǎng)介紹，可以立馬理解Iso-Seq的字面意思了。

Iso-Seq 就是 isoform sequencing，中文就是同源異構(gòu)體測序，其實(shí)也是一種 RNA 測序技術(shù)。

The challenge of isoform reconstruction（即二代的不足）：

真核組織中，大多數(shù)gene是可變剪切的，產(chǎn)生多種transcript isoforms，大大增加了基因組蛋白編碼的潛能。

同一個(gè)gene產(chǎn)生的可變剪切是大大的不同的，有時(shí)甚至?xí)鸬较喾吹男?yīng)。

為了研究基因表達(dá)，學(xué)者們往往使用二代技術(shù)，測得的是一些片段，也是就RNA-seq技術(shù)。然而，短的RNA-seq 不能跨越全長的轉(zhuǎn)錄本，也就不能精準(zhǔn)的描繪出 isoform 的不同特性。

三代的核心優(yōu)勢：

Produce full-length transcripts without assembly（不用組裝）

The isoform sequencing (Iso-Seq) application generates full-length cDNA sequences — from the 5’ end of transcripts to the poly-A tail — eliminating the need for transcriptome reconstruction using isoform-inference algorithms.

The Iso-Seq method generates accurate information about alternatively spliced exons and transcriptional start sites.

It also delivers information about poly-adenylation sites for transcripts up to 10 kb in length across the full complement of isoforms within targeted genes or the entire transcriptome.

實(shí)操：Iso-Seq學(xué)習(xí)

文章解讀：Pacbio Iso-Seq 助力玉米高粱轉(zhuǎn)錄組研究

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案例：Full-length transcriptome sequences and splice variants obtained by a combination of sequencing platforms applied to different root tissues of Salvia miltiorrhiza and tanshinone biosynthesis

2015年發(fā)的The Plant Journal，IF=5.468，丹參不同根組織和丹參酮的生物合成（全長轉(zhuǎn)錄組測序和混合測序平臺(tái)來發(fā)現(xiàn)剪切變異體）

做了什么工作：

摘要：丹參是中國傳統(tǒng)藥材，它的根莖和根有很高的價(jià)值。它對應(yīng)的生物活性成分是丹參酮，所以研究丹參酮的生物合成非常有價(jià)值，先前的轉(zhuǎn)錄組研究是基于NGS的，但是大部分的結(jié)果的 isotig 都不能代表全長的 cDNA 序列。而且這些研究都集中于整個(gè)植株和發(fā)狀根培養(yǎng)物。這里，我們證實(shí)了丹參酮色素是在根周皮中產(chǎn)生的，我們聯(lián)合應(yīng)用了NGS和SMRT技術(shù)在不同的根組織中，特別是在根的周皮，來提供一個(gè)完整的丹參的轉(zhuǎn)錄組信息，而且進(jìn)一步深入分析了丹參酮的生物合成。此外，使用SMRT測序，能夠檢測可變剪切，這里我們發(fā)現(xiàn)了檢測到的基因座中有40%的都發(fā)生了可變剪切，包括一些類異戊二烯和類萜代謝。

研究材料：丹參酮一般認(rèn)為產(chǎn)生于丹參根部周皮部，研究分別取了根部的周皮（periderm）、韌皮（phloem）、木質(zhì)（xylem）3種類型的根部組織進(jìn)行了mRNA測序。（很常規(guī)的思路，分析重點(diǎn)落在特色作物的重要功能成分上，找到該功能成分的合成場所，對該部分組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，通過分析就肯定能找到與該代謝物相關(guān)的差異表達(dá)基因，最后把其他代謝扯一扯就發(fā)了一篇文章）
研究方法：3種類型根部樣本各設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，總共9個(gè)樣本，采用Hiseq2500 PE100進(jìn)行測序，每個(gè)樣本產(chǎn)生~5G raw data 。9個(gè)樣本混合測序，采用PacBio進(jìn)行測序，建<1kb、1-2kb、2-3kb、>3kb 四個(gè)SMRT bell文庫，總共產(chǎn)生~4.8G raw data（估計(jì)一下，這個(gè)項(xiàng)目花了多少錢呢？一個(gè)樣本Hiseq轉(zhuǎn)錄組多少錢？一個(gè)PacBio轉(zhuǎn)錄組多少錢？）

主要發(fā)現(xiàn)
1)采用Hiseq2500 數(shù)據(jù)對PacBio RSII平臺(tái)所產(chǎn)生的subreads進(jìn)行了校正，最后得到了16,241個(gè)高質(zhì)量非冗余isoform。
2)基于Hiseq2500產(chǎn)生的mRNA數(shù)據(jù)的差異表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)了在根部周皮部特異表達(dá)與者高表達(dá)丹參酮合成相關(guān)基因，SmCPS1、SmKSL1、GGPS、IPI、CYP等；
3) 最后研究者使用得到的16,241個(gè)高質(zhì)量的Isoform進(jìn)行了可變剪接分析，發(fā)現(xiàn)了大約有40%檢測基因位點(diǎn)發(fā)生了可變剪接現(xiàn)象，其中有些基因參與了萜類化合物代謝及類異戊二烯代謝。

 

文章邏輯：

全文都圍繞著一個(gè)話題：tanshinone biosynthesis（丹參酮的生物合成）

引言怎么寫：

作物特點(diǎn)、價(jià)值、功效，核心功能成分的代謝途徑，揭示其機(jī)制非常重要。

前人在該方向上（轉(zhuǎn)錄組）的研究方法及結(jié)果：inducible diterpene synthases（誘導(dǎo)二萜合成酶），SmCPS1 and SmKSL1；cytochrome P450 (CYP)。主要集中于 tanshinone biosynthesis 的前提和關(guān)鍵步驟，二萜烯烴前體，最初的羥基化，牽扯到一些生物化學(xué)代謝途徑的解析。

本文使用技術(shù)的優(yōu)勢，目的及意義：1.全長轉(zhuǎn)錄組；2.dissect the root finely enough to localize tanshinone production and accumulation。

 

分析邏輯（結(jié)果）：

tanshinone積累的定位

這部分雖然簡單，但是可以顯著提升文章前后的邏輯性。 分離拍照，然后電鏡一張，UPLC成分含量分析。

Combined sequencing approach to the roots of danshen

這一步就是為了找出不同組織中的差異表達(dá)基因，使用NGS和SMRT混合測序手段，分析表達(dá)的基因。

Expression analysis indicates co-localization of tanshinone biosynthesis and accumulation

表達(dá)分析揭示tanshinone 生物合成和積累的協(xié)同定位

Co-expression analysis for the investigation of tanshinone biosynthesis

共表達(dá)分析

Alternatively spliced isoforms

可變剪切體

 

待續(xù)~

總結(jié)

以上是生活随笔為你收集整理的PacBio三代全长转录组/Iso-Seq技术及案例分析的全部內(nèi)容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問題。

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