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合作單位：Zhejiang Ocean University

參考文獻：Yuping Tang, Yafeng Zhou, Qiaojun Zhao, et al.. Process Biochemistry, 2020. DOI: 10.1016/j.procbio.2020.02.015 （IF = 3.06）

本文首次報道采用生物酶法通過MOT來制備奧利司他中間體（R）-MHOT，該研究成果為奧利司他的綠色合成奠定了基礎。

背景：

奧利司他（Orlistat）是一種有效的，特異性的，長效胃腸道脂肪酶抑制劑，可以通過抑制脂肪酶來減少飲食中脂肪的吸收，進而減輕體重。目前，奧利司他的獲得途徑主要分兩種：以天然產物利普斯他汀（Lipstatin）為起始物進行結構修飾得到；或者采用天然產物全合成方法。然而，利普斯他汀難以提取，導致患者難以負擔昂貴的醫藥費用。而全合成方法可以減少花費，是目前制備奧利司他的主要方法。

（R）-MHOT是合成奧利司他過程中非常關鍵的中間體，目前獲得（R）-MHOT的方法主要有化學合成和生物合成兩種?；瘜W方法由于ee值低，花費高等缺點難以大規模生產，因此生物合成方法是目前最具前景的合成方法。

近年來，還原酶在手性化合物的合成中發揮著重要的作用，大量的手性化合物都可以采用還原酶來合成。然而目前還沒有還原酶不對稱還原MOT產生（R）-MHOT的相關報道。本文根據之前研究的成果，采用NaSDR-G145A/I199L酶催化還原MOT產生（R）-MHOT，產量達到50 g/L。并采用分子模擬方法對該酶與MOT的結合模式及突變體產率增加的機制進行了深入研究。

方案設計：

作者先構建得到NaSDR及G145A/I199L突變體重組蛋白，并在不同溫度，pH等條件下測試酶對MOT的催化效率。最后采用分子模擬方法，研究了酶及突變體與MOT的最適催化構象，并解釋了突變體產率增加的原因。

主要結果：

在非線性回歸的分析基礎上，NaSDR和NaSDR-G145A/I199L催化MOT的Km值分別為0.08和0.11 mM，而野生型和突變體的kcat值分別為0.90/s和2.91/s，突變之后該酶的催化效率提高了3倍以上。

表1 NaSDR和NaSDR-G145A/I199L催化的動力學參數

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通過測試不同pH和不同實驗溫度對酶活性的影響，發現在pH=7和35℃附近，該酶具有較好的催化能力，如下圖所示。

圖1 pH（a）和溫度（b）對NaSDR-G145A/I199L活性的影響

最后，本文采用分子對接方法研究了NaSDR和NaSDR-G145A/I199L催化MOT的最佳構象進行了研究。首先采用同源模建方法得到蛋白的三維結構并進行合理性評估。再將MOT分別對接到NaSDR和NaSDR-G145A/I199L的催化活性位點，結果如圖2所示。從圖中可以看出，MOT主要可以結合在蛋白的疏水空腔中，與輔酶NADH具有較近的距離，適合催化反應的發生。

圖2 蛋白結構評估的拉氏圖（a）和ERRAT值分布（b），MOT在NaSDR（c）和NaSDR-G145A/I199L（d）活性位點的結合模式

為了進一步研究突變前后MOT與蛋白的結合差異以及引起催化效率變化的主要原因，圖3分析了MOT與周圍氨基酸殘基的相互作用情況。從圖中可以看出，MOT主要結合在由Ile89, Val144, Met195, Leu196, Val214, Phe260 和NADH組成的疏水性口袋中。Ser143和Tyr156可以作為氫鍵供體與MOT形成氫鍵相互作用。而突變體中，Gly145突變為Ala145，Ile199突變為Leu199，可以進一步增強活性位點的疏水性質，進而增強MOT與突變體的結合能（由-5.02增加到-5.61 kcal/mol）。并且在突變之后，MOT中的羰基碳原子與NADH的催化距離由3.00 ?減小到2.73 ?，進一步證明了突變之后更有利于MOT的催化反應。

圖3 MOT與NaSDR（a）和NaSDR-G145A/I199L（b）活性位點氨基酸殘基的相互作用，MOT在突變前后關鍵的催化距離變化（c）

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總的來講，本文通過實驗證明了NaSDR-G145A/I199L在35℃、中性條件下催化MOT產生（R）-MHOT的產量達到了50 g/L，并通過分子模擬方法從原子層面解釋了突變體產量提升的可能原因。定點突變或定向進化技術可以進一步提高該酶的催化能力，并用于大規模制備中間體（R）-MHOT。

總結

以上是生活随笔為你收集整理的短链脱氢酶催化合成奥利司他中间体的机制研究的全部內容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問題。

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