大家好，這是專(zhuān)注表觀組學(xué)十余年，領(lǐng)跑多組學(xué)科研服務(wù)的易基因。今天跟大家介紹一下易基因的新產(chǎn)品：單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（smart-seq2）。

時(shí)下火熱的10X Genomics公司Chromium解決方案無(wú)法滿足某些特殊或者少量細(xì)胞樣本甚至單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組研究。Smart-seq2技術(shù)在單細(xì)胞水平對(duì)帶Poly（A）的RNA進(jìn)行全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增及高通量測(cè)序，能夠滿足高靈敏度、低偏好性的cDNA擴(kuò)增，得到全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本，實(shí)現(xiàn)高水平的序列模板轉(zhuǎn)換。

Smart-seq2技術(shù)有較好的覆蓋范圍，可檢測(cè)到稀有轉(zhuǎn)錄本，無(wú)需額外的專(zhuān)業(yè)設(shè)備，應(yīng)用范圍較廣，可以解決傳統(tǒng) RNA 定量技術(shù)在早期胚胎發(fā)育、干細(xì)胞、癌癥、免疫等研究領(lǐng)域中存在的樣品量極低或細(xì)胞異質(zhì)性的問(wèn)題，是在單細(xì)胞水平研究基因表達(dá)強(qiáng)有力的工具，極大地拓展了RNA-seq 的應(yīng)用范圍。

技術(shù)優(yōu)勢(shì)：

（1）起始量低：1-1000個(gè)細(xì)胞或10pg-10ng total RNA即可高效擴(kuò)增；

（2）轉(zhuǎn)錄本覆蓋度高：通過(guò)雙端引物擴(kuò)增全長(zhǎng)cDNA，獲得全轉(zhuǎn)錄組信息，避免3’端和5’端偏好性，產(chǎn)物完整性好；

（3）檢測(cè)靈敏度高：大幅度增加了低表達(dá)基因的檢出量;

（4）堿基分辨率高：可達(dá)單堿基分辨率，且可以定位到具體基因的具體轉(zhuǎn)錄本;

（5）實(shí)驗(yàn)可控：質(zhì)控點(diǎn)多，可從實(shí)驗(yàn)的開(kāi)端判斷細(xì)胞狀況。

研究方向：

可應(yīng)用于細(xì)胞分子機(jī)制中細(xì)胞異質(zhì)性研究，解決因樣本量少而無(wú)法進(jìn)行高通量測(cè)序的情況。

免疫學(xué)研究

腫瘤及微環(huán)境研究

繪制組織精細(xì)化表達(dá)圖譜

早期胚胎發(fā)育

實(shí)驗(yàn)策略：

Smart-seq2建庫(kù)技術(shù)流程圖

分析內(nèi)容：

標(biāo)準(zhǔn)信息分析（需提供參考基因序列、參考基因組序列及基因注釋結(jié)果）	高級(jí)信息分析	定制化信息分析
測(cè)序質(zhì)量評(píng)估與原始數(shù)據(jù)過(guò)濾，去除接頭序列及低質(zhì)量reads；比對(duì)參考基因組或參考基因序列；測(cè)序與比對(duì)評(píng)估：數(shù)據(jù)比對(duì)統(tǒng)計(jì)，測(cè)序飽和度分析，測(cè)序隨機(jī)性分析；基因表達(dá)統(tǒng)計(jì)：基因覆蓋度，表達(dá)量，表達(dá)量豐度分布；新基因的轉(zhuǎn)錄本預(yù)測(cè)及注釋（需有參考基因組）；樣本關(guān)系分析：主成分分析（PCA）、相關(guān)性檢驗(yàn)、樣本聚類(lèi)圖；差異表達(dá)基因分析：差異表達(dá)基因篩選，差異基因表達(dá)模式聚類(lèi)分析（熱圖），差異基因GO功能富集分析、KEGG通路富集分析、DO基因疾病富集分析（人）、Reactome通路富集分析（人、大鼠、小鼠）；String數(shù)據(jù)庫(kù)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析；GSEA基因集富集分析。	SNP分析；基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化（需有參考基因組）；基因可變剪切鑒定（需有參考基因組）。	基因表達(dá)趨勢(shì)分析（需要三個(gè)或以上有處理梯度的樣品）：利用STEM軟件將基因按照表達(dá)模式分為不同的趨勢(shì)、各趨勢(shì)基因的GO/KEGG功能富集分析、特定基因集聚類(lèi)分析；權(quán)重基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA）（至少15個(gè)樣本）：根據(jù)基因表達(dá)模式進(jìn)行模塊劃分、樣本表達(dá)模式分析、模塊基因表達(dá)模式分析、性狀-模塊相關(guān)性分析、各模塊基因的GO/KEGG功能富集分析、基因間調(diào)控關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖。

送樣要求：

經(jīng)典案例

Bj?rklund 等利用Smart-seq2單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序揭示人CD127+先天淋巴細(xì)胞的異質(zhì)性

The heterogeneity of human CD127(+) innate lymphoid cells revealed by single-cell RNA sequencing

先天淋巴細(xì)胞（ILCs）是一種免疫細(xì)胞，它通過(guò)釋放可溶性的因素調(diào)節(jié)對(duì)病毒、細(xì)菌和寄生蟲(chóng)的早期免疫反應(yīng)。這些細(xì)胞可以根據(jù)細(xì)胞表面的轉(zhuǎn)錄因子及細(xì)胞因子被分為三個(gè)亞型，每種亞型都有不同的功能。利用流式細(xì)胞儀分選患有阻塞性睡眠呼吸暫停綜合癥患者的扁桃體組織中的ILCs（Lin?CD127+）和NK cells（CD45+Lin?CD127?NKG2A+CD56+CD16? ）。采用Smart-seq2進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增建庫(kù)；Illumina HiSeq 2000 3M reads /樣本進(jìn)行測(cè)序分析。采用PCA（主成分分析）和t-SNE對(duì)ILC中847個(gè)表達(dá)的基因進(jìn)行分型分析，將細(xì)胞分為4類(lèi)：ILC1、ILC2、ILC3、NK cells。應(yīng)用SCDE軟件包對(duì)4類(lèi)細(xì)胞的差異基因進(jìn)行分析，找出共有及特有差異基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CD127+ILCs中共有的差異基因的表達(dá)量比NK細(xì)胞中明顯要高。ILC1、 ILC2、ILC3差異基因表達(dá)分析，結(jié)果表明，ILC1 cells共有79個(gè)上調(diào)表達(dá)基因，參與干擾素γ的調(diào)控，ILC2 cells共有58個(gè)上調(diào)表達(dá)的基因，在前列腺素、Notch信號(hào)通路及環(huán)境感應(yīng)中發(fā)揮作用，ILC3 cells共有371個(gè)上調(diào)表達(dá)的基因，根據(jù)GO注釋有85個(gè)與免疫相關(guān)，且存在未知功能的基因。

采用PCA和t-SNE分析ILC3中1,958個(gè)注釋的免疫基因，將ILC3分為3個(gè)亞型：Cluster A、Cluster B、Cluster C, 通過(guò)對(duì)這3種亞型細(xì)胞的分析，發(fā)現(xiàn)了新的免疫細(xì)胞CD62L+ ILC3。本研究通過(guò)對(duì)648個(gè)單細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，應(yīng)用t-SNE細(xì)胞分型、SCDE基因差異表達(dá)分析，在ILC3中發(fā)現(xiàn)新的免疫細(xì)胞CD62L+ ILC3。

參考文獻(xiàn)：

Bjorklund, A.K., et al., The heterogeneity of human CD127(+) innate lymphoid cells revealed by single-cell RNA sequencing. Nat Immunol, 2016. 17(4): p. 451-60

總結(jié)

以上是生活随笔為你收集整理的易基因单细胞转录组测序（smart-seq2）｜技术推介的全部?jī)?nèi)容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問(wèn)題。

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