摘要：

南方水稻黑條矮縮病是威脅我國水稻生產的重要病毒病害之一,由南方水稻黑條矮縮病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus, SRBSDV)引起。該病毒屬于呼腸孤病毒科(Reoviridae)斐濟病毒屬(Fijivirus)。主要由遷飛性的白背飛虱(Sogatella furcifera)以持久增殖型方式傳播,不經卵傳播,白背飛虱一旦獲毒則終身帶毒；灰飛虱(Laodelphax striatellus)也可以帶毒,但不能傳毒。水稻一旦發生該病即沒有有效藥物或方法進行治療,而且發病植株將作為侵染源被介體白背飛虱向周圍健康水稻傳播病毒,將加重田間的病害發生。因此需及時檢測田間水稻和介體昆蟲的帶毒情況,盡早拔除發病植株,滅殺田間介體昆蟲,從而阻斷病害的擴散。目前檢測病毒的方法較多,常用RT-PCR法檢測SRBSDV,但該方法存在操作復雜、耗時、成本高等缺陷,不適用于大批量樣品的檢測。 為了建立快速、簡便、特異性的病毒檢測技術,本研究優化了免疫捕獲反轉錄擴增(Immunocapture reverse transcription, IC-RT-PCR)和逆轉錄環介導等溫擴增(Reverse transcription loop-mediared isothermal amplification, RT-LAMP)體系,用于檢測水稻和介體昆蟲中的SRBSDV。通過對免疫捕獲抗體的篩選,明確SRBSDV P9-1蛋白的多克隆抗體可用于免疫捕獲反轉錄擴增檢測技術,用于捕獲水稻或介體昆蟲中的病毒,從而捕獲病毒RNA,用于RT-PCR檢測病毒。通過對環介導等溫擴增技術Mg2+濃度、dNTP濃度、反應溫度以及鈣黃綠素用量的優化,建立了適合檢測SRBSDV的RT-LAMP檢測方法,并將RT-LAMP方法應用于檢測2013年不同地區采集到的水稻病樣和介體昆蟲的帶毒率。此外,本研究通過原核表達蛋白制備了RBSDV編碼蛋白P9-1的多克隆抗體,Western blot實驗表明所制備的抗體可特異性檢測RBSDV侵染水稻中的P9-1蛋白,并可通過IC-RT-PCR方法檢測RBSDV侵染的褐飛虱。 通過對檢測方法的比較,本研究所建立的RT-LAMP較IC-RT-PCR方法靈敏。由于IC-RT-PCR不需要提取RNA,避免了提取單頭昆蟲RNA的困難,因此比較適用于單頭飛虱帶毒檢測；而RT-LAMP方法可同步進行反轉錄和PCR,與常規RT-PCR方法比較縮短了檢測時間,因此適用于水稻樣品的快速檢測。本研究對RT-LAMP和IC-RT-PCR檢測方法的優化豐富了水稻病毒的檢測技術,有利于田間水稻病毒病害的監測和診斷。

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總結

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