【教程】Western 操作步骤
實驗原理：
Western,也稱Western blot、Western blotting、Western印跡，是用抗體檢測蛋白的重要方法之一。Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳,被檢測物是蛋白質,“探針”是抗體,“顯色”用標記的二抗。經過PAGE分離的蛋白質樣品,轉移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上,固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質,且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原,與對應的抗體起免疫反應,再與酶或同位素標記的第二抗體起反應,經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術也廣泛應用于檢測蛋白水平的表達。
內參:
WB過程監測以及目的蛋白定量的標準;最重要和最不可或缺的對照就是內參照。
1.內參可檢測整個WB實驗過程及體系是否正常工作,如果一個實驗連內參照都出不了陽性結果的話（在內參抗體有效的情況下）,那么這個體系就是存在問題的；
2、起半定量的標準的作用,內參一般選擇管家基因編碼表達的蛋白,在很多組織和細胞中都是穩定表達的,因此可以作為檢測靶蛋白表達量的標準；
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實驗步驟
一、蛋白樣品制備（組織中總蛋白的提取）
第一步：
法（1）敲取0.07-0.1g組織+400-500ul裂解液，放入打樣管，放入打樣機打樣。
法（2）實驗室研缽研磨：取稍大于0.1g的樣品放入研缽中，來回磨，至粉末狀，用槍頭刮取收集入離心管。
注：任何操作都要在液氮中進行，并且要將槍頭和離心管提前泡在液氮中。
第二步：取出的樣品放置冰上1-2h（中間混勻5-6次）直至裂解完全。
第三步：樣品離心*2，取上清于新的EP管中。
（離心條件：13000rpm，4℃，30min）
注：離心機提前預冷至4℃。
二、蛋白含量的測定
第一步：在96孔板第一列1-8分別為濃度為0,1,2,4,6,8,9,10倍的蛋白標準液+水=10或20ml，再加上5倍稀釋的考馬斯亮藍染液200ml。
第二步：在96孔板后面幾列依次加入稀釋的蛋白樣品或原液10-20ml以及5倍稀釋的考馬斯亮藍染液200ml。
注：原液濃度太高時進行稀釋，用裂解液稀釋。
三、電泳
第一步：清洗玻璃板
第二步：配膠
（1）玻璃板對齊后放入夾中卡緊,然后垂直卡在架子上準備灌膠。
（2）配分離膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。待膠面升到玻璃板3/4位置時即可。然后膠上加一層水，液封后的膠凝的更快。
注：加水液封時要很慢，否則膠會被沖變型。
（3）當水和膠之間有一條折射線時，說明膠已凝了。倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。配濃縮膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。待到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。
注：插梳子時要使梳子保持水平。
（4）用水沖洗一下濃縮膠，將其放入電泳槽中。（小玻璃板面向內，大玻璃板面向外。若只跑一塊膠，槽另一邊要墊一塊塑料板且有字的一面面向外。）
第三步：上樣
（1）測完蛋白含量后，計算含50mg蛋白的溶液體積即為上樣量。適量蛋白加入4：1 5*Loading Buffer于離心管，100℃水中煮5min使蛋白變性。放置冰上3min，離心15min，13000rpm，4℃。
（2）加足夠的1*電泳緩沖液后開始準備上樣。（電泳液至少要漫過內測的小玻璃板。）用微量進樣器貼壁吸取樣品，將樣品吸出不要吸進氣泡。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品。（加樣太快可使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品溢出。）
第四步：電泳
濃縮膠80V電壓跑20分鐘，可多跑幾分鐘；分離膠180V電壓跑至底端。
第五步：停止電泳
純水沖洗玻璃板，取膠，清洗切去濃縮膠，在Marker下方切角做標記，將膠泡在清水中。
四、轉膜（跑膠時準備轉膜用品,最主要趕氣泡）
第一步：剪PVDF膜,并提前切個角，甲醇中泡2-3min。
第二步：將膜、海綿、濾紙一起泡入1*轉膜液中，放4℃保存。
注：轉膜液可回收。
第三步：將夾子打開使黑的一面保持水平。在上面墊一張海綿墊，用玻棒來回搟幾遍以搟走里面的氣泡。(一手搟另一手要壓住墊子使其不能隨便移動。)在墊子上墊2層濾紙，一手固定濾紙一手用玻棒搟去其中的氣泡。將膠蓋于濾紙上，輕輕用玻棒搟去氣泡。將膜用鑷子蓋于膠上，并除氣泡。在膜上蓋2層濾紙并除去氣泡。最后蓋上另一個海綿墊，合起夾子。整個操作在1*轉膜液中進行，要不斷的搟去氣泡。膜兩邊的濾紙不能相互接觸，接觸后會發生短路。
第四步：將夾子放入轉膜槽槽中，黑對黑,對紅。電轉移時會產熱，過熱有可能造成蛋白質的降解，同時大量產熱，會使凝膠膨脹，有可能在膠和膜之間產生空隙，引起轉膜不均勻，所以在轉膜槽中放入冰盒，在冰水混合物中進行轉膜。
注：轉膜條件是電流300mA或電壓70V，2h；另一個約束條件就是電壓必須控制在60-70V，調節電流。
第五步：轉完后將膜放入裝水的小盒中沖洗，倒水后，加5%的封閉液，搖床封閉1h。
五．抗體孵育,免疫反應
第一步：回收封閉液,加入一抗,搖床30min-1h，4℃過夜,再孵育30min-1h。
第二步：一抗回收，用PBST洗，洗5次，每次5min。（少時多次）
第三步：加二抗，孵育2h。
第四步：二抗回收，用PBST洗，洗5次，每次5min。（少時多次）
第五步：純水沖洗5-7次，倒掉純水，加化學發光，膜在化學發光中浸泡2-3min，成像。
CSL（利斧科學）電泳個性化定制解決方案根據樣本數、膠尺寸、緩沖液容量的不同提供各種不同的配置組合
Cleaver Scientific的 multiSUB水平凝膠電泳裝置 是由科學家設計的，考慮到 實驗室環境。我們的 multiSUB水平電泳槽提供了 一個易于使用和靈活的平 臺，以滿足您所有的水平電泳要求。該系統具有廣泛的槽和托盤 尺寸以及許多梳狀選擇，可 以處理各種電泳實驗。我們的multiSUB系列水平凝膠裝 置提供目前市場上最通用的 DNA和RNA瓊脂糖凝膠電泳 解決方案。MSMINI、 MSMIDI、MSCHOICE、 MSCHOICEST、MSMAXI、 MSCREEN、miniRAPIDE、 MSMIDI96和miniONE都提供 了無與倫比的凝膠和緩沖液 體積組合，凝膠大小和樣品數量的多功能性。
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multiSUB?水平電泳系列提供多種針對DNA和RNA瓊 脂糖凝膠電泳
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?采用一體成型注塑制造，提供耐久，防 漏的特性，保證實驗安全性和設備持久 耐用
?嵌入式電極設計，更換更加簡便
?電極為99.99%的純鉗金，同時耐腐蝕
?用電安全，頂蓋固定在一個方向上，當 移開頂蓋時，電源自動沖緩沖液中斷開
?多種凝膠托盤尺寸選擇，減少使用過多 的電泳槽
?獨特的電泳冷卻系統
?按壓式的頂蓋更方便取下
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五個水平電泳槽選擇，提供了一個無 與倫比的組合經濟的凝膠和緩沖容量 凝膠的大小和樣品數的多樣選擇性。
凝膠尺寸和樣品數量要求可以在每個單元中精確匹配， 還可以選擇額外的凝膠托盤尺寸。這減少了需要多個 電泳槽來改變凝膠大小或應用。
所有電泳槽的特點是使用可移動的紫外線透明托盤。 為了獲得最佳效率和通用性系統可以提供一個、兩個或 三個凝膠托盤選項（取決于電泳槽型號）。易于使用，防 泄漏的“即插即用''凝膠澆注壩被列入標準，允許凝膠快 速澆注，同時多亞單元用于凝膠運行。在托盤上沒有凹 痕或澆口凹槽來干擾樣品的進樣。同時也可以使用傳統 的膠帶封口。.
蓋子連接器與大多數主要電源兼容同時提供額外的適配器可以提供完全的兼容性.
凝膠托盤
凝膠托盤是紫外透明的沒有凹痕或澆口通道，減少對樣本的干擾
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獨特的ClearSight
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ClearSight頂蓋解決了冷凝堆積問題，提供一個完全透明的頂蓋 觀察凝膠和染料的運行進程。這是通過USB實現的電動抽風機內 蓋。Clearsight蓋子是可作為完整系統的組件或作為升級。
緊湊和易用的omniPAGE垂直電泳提供快速的制膠和上樣
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Cleaver Scientific提供一 系列全面的垂直電泳系統-包 括槽插入物和試劑-以滿足不 同凝膠大小和處理量的各種 應用和技術。omniPAGE系列 包括三種尺寸的凝膠室，迷 你型10 x 10 cm，迷你型20 x 10 cm和波浪型最大20 x 20 cm。每個系統都有保證的防 漏密封，從而實現無故障和 快速凝膠澆鑄。 這些系統是SDS-PAGE或原 生聚丙烯酰胺凝膠的理想選 擇。每個凝膠罐系統包括一 個無泄漏鑄造選項，可鑄造 您自己的聚丙烯酰胺凝膠， 而omniPAGE mini可使用所 有主要制造商的各種商用預 制凝膠。
三種尺寸,Mini 10 x 10cm, Mini Wide 20 x 10cm, WAVE Maxi 20 x 20cm,具有許多 共同的特點，包括確保無漏密封，快速和 簡單的制膠。內置的制膠跑膠模塊，消除了傳 統制膠過程中玻璃板轉移的時間消耗，這一過 程會導致凝膠損壞和錯位。
具有永久粘結墊片的玻璃板保證了墊片的完美 對準。
玻璃板夾芯結構簡單，夾在壓桿之間，密封使 用，使用方便，可使用滑動門或WAVE MAXI鎖定系統。
這確保了快速安裝時間，而均勻的壓力和超軟 密封確保制膠的防泄漏。
凝膠完成后，將凝膠運行模塊簡單插入電泳槽 進行實驗。
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omniPAGE MINI垂直電泳組成
1. 頂蓋和電源線；2. PAGE模塊；3. 滑動門；4. 玻璃；5. 內緩沖液室；6. 墊片；7. 外部電泳槽；8. 制膠底座；9. 超軟制膠墊；10. 梳子
操作示例
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powerPRO電泳電源 提供行業領先的規格和價值
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無論您需要用于常規水平 DNA瓊脂糖凝膠電泳的電 源，還是對于技術要求很高 的技術（如大幅面垂直的 SSCP分析），還是使用 IPG條帶的第一維IEF， Cleaver Scientific都可以通 過其全面的電源滿足您的需 求。每個電源都有一個緊湊 的設計，這意味著實驗室占 地面積小，而解釋性的自我 提示菜單使設置變得容易。 此外，這些電源符合 IEC61010標準，這是世界上 最嚴格的電氣安全標準之 一。我們的電源采用標準的 4毫米香蕉插頭式連接器，與 我們自己的電泳槽和其他制 造商的電泳槽兼容。
計時不間斷：999 （分鐘）鬧鐘預設模式999（分鐘）鬧鐘
結合卓越的規格，性能，可靠性和無與倫比的價值
每個電源都有一個2.4”的LCD顯示器，顯示可用的選項以及當前的運行條件。恒定的電壓， 電流和電源選項，以及預編程或用戶可編程程序，允許用戶保存和重復他們的實驗條件。5 組電源輸出意味著相同數量電泳槽只需要較少的電源，當同時運行多個電泳槽時節約成本和 時間。
3AMP：完美兼容垂直電泳omniPAGE Maxi. 同時兼容轉印系統omniBLOT和半干轉 印.
規格 300V, 3000mA, 300W, powerPRO 3AMP是專為幾乎所有的大電流電泳應用而 設計的。
powerPRO 3AMP的高電流輸出能力非常適合于具有高 強度平板電極，特別是Cleaver Scientific omniBLOT maxi,VS20WAVE和半干式轉印系統。電傳輸可以在恒 定或可編程模式下以定時運行來執行，以防止過熱和緩 沖液耗盡。在恒定模式下可延長到最大999分鐘的運行 時間對于以恒定小電流進行的過夜轉換也是有用的。 powerPRO 3AMP共享其他powerPRO型號的內置協議和 常數參數特性。
300V：常規用于水平電泳，如multiSUB Mini, Midi and Choice，也可用于垂直電泳omniPAGE Mini.
powerPRO 300是一套多樣性的平臺電 源兼容不同的電泳應用在300V, 700mA和150W功率PR0300具有幾乎兩 倍的電流和電力市場領先的等效單位。非常適合與 Cleaver Scientific的多個SUB范圍的水平電泳系統和 omniPAGEMini垂直電泳系統一起使用。powerPRO 300甚至已經從運行CleaverScience的每個電泳系統 內置了預置協議，并且允許用戶創建和保存他們自己的系統的協議。
500V：常規應用于水平電泳，如multiSUB Mini, Midi and Choice.也可用于垂直電泳omniPAGE Mini、Cleaver Scientific DGGE變性梯 度電泳、垂直電泳omniPAGE Maxi。
powerPRO 500具有最大500V、 800mA和300W電壓、電流和功率輸 出，是一種優秀的通用電源，適合最廣 泛的電泳應用。
它可以在一個恒定或可編程的設置下運行多達五個 單元，并且能夠存儲多達30個編程文件，每個文 件只需6個步驟。這使得powerPRO 500非常適合 需要電氣參數需要細微和逐步變化中受益的應用。
例如使用Cleaver Scientific VS20-DGGE和WAVE系 統的DGGE和大格式垂直PAGE電泳。powerPRO 500甚至在運行CleaverScience的每個電泳系統時 都內置了預置協議，并且允許用戶創建和保存他們 自己的程序。
chemiLiTE凝膠成像儀
通過專用的化學發 光成像儀傳遞高敏感度和易用性。
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Cleaver Scientific提供一系列 凝膠成像系統，從我們的入 門級microDOC Basic到一體 化的DNA和蛋白質成像 omniDOC。 omniDOC系統提供了一個簡 單但復雜的成像解決方案， 同時提供了許多最高規格系 統中包含的功能，但沒有額 外的價格。omniDoc適用于大 多數熒光和比色凝膠的成 像，具有高分辨率500萬像素 CMOS傳感器，帶滑出式紫外 線透射器，可選藍色外照射 模塊和白光表。 Cleaver Scientific還為化學和 熒光成像提供一系列化學發 光記錄系統。所有系統都包 括直觀的采集和分析軟件， 使采集和分析凝膠盡可能容易。
系統的化學發光系統可捕獲化學發光信號，以檢測 Western blots上的目標蛋白，其靈敏度可與膜成 像媲美或優于膜成像
- 占用空間小
緊湊的尺寸占用最小的實驗空間，允許更多的實驗空間
- 高量子效率(QE)相機
檢測微弱的條帶
- 自動化學發光捕獲
完美無膜曝光
- 冷光鏡頭
Blots上沒有惱人的背景噪音
- 固定鏡頭由GENEPIX軟件控制
一鍵成像任何制造商的化學發光試劑
- GENEPIX應用驅動的圖像捕捉軟件
包含各種染料和成像協議的廣泛數據庫。選擇類型的印跡和genePIX自動選擇最優的照 明和過濾器，以產生完美的圖像。
- GENEQUANT分析軟件(無限拷貝)
在你自己的電腦上分析數據
- 優化-用于化學發光WESTERN BLOTS成像
chemiLITE配置為最高靈敏度，以確保即使是印跡上最微弱的條帶也能被捕獲。
- 敏感的相機
高量子效率的冷CCD相機對印跡發出的低水平光非常敏感。Peltier冷相機具有卓越的 "signal to noise”性能，減少検測的背景噪聲。縮短的“相機到樣品”距離進一步提高了與 化學發光樣品和試劑的工作能力。與薄膜相比，化學試劑的動態范圍增加了一倍以上。 這就保證了精確的量化。
genePIX采集軟件可以設置為單次自動采集、系列采集 或手動采集的Westerns,生成一個或一系列定時圖像
更明亮的Western blot
當弱光化學發光Westerns成像時，Binning特征可以減少曝光時 間。Binning將像素組合成更大的格式，生成一個超級像素，它 可以收集更多的光，提高靈敏度或加快圖像采集時間。
完美的照片
要制作需要印刷出版的Westerns圖片，只需在genePIX軟件的有 效分辨率設置中選擇高分辨率圖像即可。genePIX軟件允許對 Westerns圖像進行自動疊加，它甚至可以在化學發光條 帶旁生成比色分子量標記的圖像。
快速圖像分析
chemiLITE自帶geneQUANT圖像分析軟件，可用于自動 計算分子量和蛋白質條帶的相對定量等應用。
使用geneQUANT可以進行圖像編輯，數據可保存為圖 像文件，或導出到Microsoft Excel和Word。
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多重熒光和化學發光成像儀
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?化學發光成像
?熒光條帶或者QDOTS, DYLIGHT, ALEXA, CY染料 和Licor IR染料染色條帶
?無染色膠
?生物熒光
?植物成像
?體內成像
? ETBR或者SAFE染色的瓊脂糖膠
? 2d膠
化學發光、熒光和可見染料有這么 多成像方法，你需要知道哪種成像 系統能真正捕捉到真實的結果在Cleaver Scientific,我們的專家在圖像分析系統方面有多年的經驗，在此期間，我們將客戶的經驗和反饋與我們對 成像科學的廣泛理解結合在一起，提供了一個 高性能的系統，但具有簡單的自動化，實驗室中的任何人都可以使用.對于印跡和凝膠的結果。
準確性通過結合冷卻的高分辨率相機和獨特的光學成像技術， chemiPRO可以生成逼真的圖像，而不僅僅是數字增強 的圖像有了chemiPRO,即使在復雜的凝膠上也可以分辨出 緊密的chemi和熒光帶或斑點，并知道它們是真實的
敏感性chemiPROM統是多用途的電源，用于準確的熒光成像， 多重western,瓊脂糖DNA凝膠，可見蛋白凝膠，無染色凝 膠和化學
印跡該系統完全集成了計算機控制的直觀的genePIX軟件， 使化學反應的4.80D動態范圍可以一次又一次地檢測 出femtogram數量的DNA和蛋白質。
智能化學發光
當成像化學發光墨跡時，通常很難得到正確的曝光時間 通過使用genePIX,可以對chemiPRO進行設置，根據需要 快速還是高質量的圖像來提供最佳曝光 由于化學的動 態范圍比x射線膠片好，因此也將產生更精確的量化數據，甚至可以捕捉到可見的蛋白質標記的圖像，使用genePIX,這些圖像可以疊加在化學發光圖像上，使分子質量的計算更容易。
北京澤平科技專業電泳設備供應18年。北京澤平一直致力為中國用戶提供全球最先進的生物試劑、科學儀器、實驗室消耗品、化工原料及醫藥中間體等技術服務。 澤平科技成立至今，已與近百家國際一線技術供應商品牌建立了長效穩定合作機制，產品技術服務囊括近20000多個品類。立足北京，放眼全球，澤平科技“以最先進技術服務用戶”為己任，國內服務用戶已超過20000家。歡迎留言咨詢!參考文獻
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總結
以上是生活随笔為你收集整理的【教程】Western 操作步骤的全部內容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問題。
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