本篇文章，我們將對應用較廣的雙淬滅探針（Double-Quenched Probe）做詳細的介紹。

基于qPCR測試的結果，我們已將TaqMan??探針替換成為IDT PrimeTime?? 雙淬滅探針。ZEN??型雙淬滅探針非常適合我們甲基化生物標志物的相關研究工作。靠近5'熒光基團的淬滅劑ZEN??，不僅可以使qPCR探針在長達40堿基的情況下依舊保持較好淬滅效果，而且顯著增加了探針的Tm值，非常適合癌癥相關研究。 – 安朵涅特·佩里 博士 高級研究員 愛爾蘭都柏林三一學院分子藥物研究所

“雙淬滅”探針顧名思義，就是有兩道“消防線”來保證熒光基團的淬滅：在普通的5'核酸酶水解探針（圖1. A）的基礎上，除了探針3'端的普通淬滅基團（例如，Black Hole Quencher等），另在探針中間額外添加淬滅基團。

以IDT生產的經典雙淬滅探針為例（圖1. B）：在探針第9、10堿基之間添加專利的ZEN??或TAO??淬滅劑，與3'端IDT改進的專利淬滅基團—Iowa Black?? Dark Quencher（IBRQ或IBFQ），構成兩道“消防線”。

圖1. 普通5'核酸酶水解探針和雙淬滅探針的結構（D：Dye，熒光染料；Q：Quencher，淬滅基團；Z：ZEN??）

除了對熒光的淬滅作用，ZEN??還可以增強雙鏈結構的穩定性，阻止核酸外切酶的酶切作用，且無細胞毒性。這些特性使其被IDT廣泛應用于anti-miRNA序列（anti-miRNA oligonucleotides），splice-switching序列（splice-switching oligonucleotides）和miRNA、mRNA及InRNA的原位雜交探針。

IDT目前有ZEN??型和TAO??型兩種雙淬滅PrimeTime?? qPCR探針（圖2），分別搭配不同的熒光基團，兩道“消防線”，滅“火”于無形之中。

圖2. IDT雙淬滅qPCR探針結構

技術優勢

更低的背景

正如文章開篇佩里博士所陳述，雙淬滅系統最重要的優勢是能夠降低熒光背景噪音，實現高信噪比，從而減少qPCR實驗中由高背景導致的假陽性。

如圖3所示，使用ZEN?型雙淬滅探針（藍色）qPCR的背景熒光值僅為單淬滅探針（綠色）的1/4。

圖3. 與普通單淬滅5'核酸水解探針相比，ZEN??型雙淬滅探針淬滅效果更強，背景信號更低。

一般來講，熒光染料和淬滅劑的距離變長會出現更多的熒光“泄漏”。這時候，兩道“消防線”的雙淬滅探針便脫穎而出。如圖4所示，qPCR探針長度在20或40個堿基，雙淬滅探針均可將背景熒光維持在較低的水平。

正如篇首所示，佩里博士在甲基化相關研究中，為了使探針的Tm值比引物高10°C 以上，設計了很多40堿基左右的雙淬滅探針，測試后對其表現大為贊賞。

圖4. 單/雙淬滅探針對不同長度序列的淬滅效果

更為突出的是，雙淬滅探針在定量甲基化特異擴增檢測（Quantitative Methylation-specific PCR, qMSP）中優勢盡顯。未甲基化的CpG位點，經過亞硫酸鈉處理后，會變成AT-rich區域，在較廣長度范圍內均可正常“施展”的雙淬滅探針，可以較多的結合CpG位點，高效幫助研究人員探究甲基化的奧秘[1]。

更高的靈敏度

ZEN??型雙淬滅探針與單淬滅探針相比，qPCR實驗Cq值降低，靈敏度升高。IDT在7900HT Real-Time PCR 系統標準循環條件下，對比5種qPCR探針在不同的cDNA起始量（0.005 ng - 5 ng）β-Actin的Cq值。結果顯示，ZEN??型雙淬滅探針在不同的起始量下，平均Cq值均維持在最低的水平[2]。

圖5. 與單淬滅探針相比，雙淬滅探針在不同起始量下平均Cq值更低

2016年1月，瑞典烏普薩拉大學醫學部臨床病毒學的Hongyan Xia等人發表了利用巢式實時定量PCR檢測諾如病毒（Norovirus）基因組II（Genogroup II，GII）的研究論文[3]。在針對諾如病毒的高度變異序列研究中，使用了長引物和長qPCR探針（多達56堿基）對GII進行檢測。

研究人員測試了4種探針：LGC生產的內部不同位置加BHQ1的探針（如圖6. A & B）和IDT生產的內部加ZEN??的探針（單ZEN??雙淬滅探針和雙ZEN??三淬滅探針，如圖6. C & D）。

圖6. LGC和IDT生產的4種檢測諾如病毒的qPCR探針結構

測試結果表明，LGC生產的NoProbe 1和NoProbe 2的檢測下限分別為1000 copies / reaction和100 copies / reaction，而IDT的ZEN??型探針NoProbe 3和NoProbe 4的檢測下限低至10 copies / reaction，甚至6孔中的3個達到1 copy / reaction。

圖7. 對諾如病毒GII通過qPCR制作標準曲線.?(A) Noprobe 1. (B) Noprobe 2. (C) Noprobe 3. (D) Noprobe 4.

IDT 雙淬滅探針具有高靈敏度，不僅適用于高拷貝數的臨床樣本，也可用于環境和食品檢測或低拷貝數的病毒檢測[3]。

2017年德克薩斯大學藥學院Xiujuan Peng等人發表在Journal of Virological Methods的文章中，使用IDT雙淬滅探針和SYBR Green的qPCR方法均可對M13和T7噬菌體進行檢測。與酶聯免疫吸附試驗（ELISA）相比，qPCR方法可提高檢測靈敏度和重復性。正是使用了ZEN??型雙淬滅探針，使得M13和T7噬菌體的檢測范圍低至27.5 copies/μL和 26.6 copies/μL[4]。

降低多重qPCR通道間串擾

雙淬滅探針有效降低背景信號的特性，還可以幫助實現多重qPCR（Multiplex qPCR），有效減少不同通道之間的串擾[4]。下面我們將通過一個IDT雙淬滅探針應用于多重檢測的實例來了解兩道“消防線”帶來的“品質保證”。

來自美國Tetracore公司的研發人員一直致力于研發基于qPCR的傳染病等診斷試劑，其檢測產品因適配多種PCR平臺，且在各種環境條件下表現穩定，為軍隊、動物檢疫等機構提供了解決方案。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus, PRSSV）可引起豬群多系統病癥。PRSSV主要包含美洲型（American-like）和歐洲型（European-like）兩種大類，對PRSSV進行分類需要檢測多個位點。Tetracore公司開發的檢測方案，包含34條引物和8條qPCR探針，可以同時進行多重qPCR檢測。其中8條qPCR探針利用了3種熒光基團，可以在3通道的qPCR平臺進行檢測，1個通道檢測對照組，其余7條探針分別用其他兩個通道進行檢測（表1）。

表1. PRSSV檢測探針熒光基團與對應通道

多重通道檢測熒光信號的串擾是個令人煩惱的問題。為了使PRSSV多重檢測分辨率提高，研發人員引入了ZEN??型雙淬滅探針，即5'FAM/ZEN/3'IBFQ探針，與普通的單淬滅探針相比，可有效降低假陽性，減少背景熒光。如圖8所示，利用18堿基的5'FAM修飾的qPCR探針對長度為120 bp PRRSV區域進行檢測，其中B11和B12（紅色）代表5'FAM/3'BHQ單淬滅探針，A7和A9（藍色）代表5'FAM/ZEN/3'IBFQ雙淬滅探針[5]。ZEN??使FAM熒光在測試的過程中不再干擾相鄰的Cy3通道。

圖8. ZEN??型雙淬滅探針解決了多重qPCR中的熒光“泄露”問題

性價比高

目前IDT提供ZEN??型和TAO??型兩種雙淬滅PrimeTime?? qPCR探針，其搭配的熒光基團如表2。

表2. IDT提供雙淬滅探針詳情

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參考文獻

[1]https://www.idtdna.com/pages/education/decoded/article/epigenetic-biomarkers-for-prostate-cancer

[2]http://www.idtdna.com/pages/education/decoded/article/zen

[3]Xia, H., S. Gravelsina, C. Ohrmalm, J. Ottoson and J. Blomberg (2016). "Development of single-tube nested real-time PCR assays with long internally quenched probes for detection of norovirus genogroup II." Biotechniques 60(1): 28-34.

[4]Peng, X., A. Nguyen and D. Ghosh (2018). "Quantification of M13 and T7 bacteriophages by TaqMan and SYBR green qPCR." J Virol Methods 252: 100-107.

[5]https://www.idtdna.com/pages/education/decoded/article/optimizing-multiplex-qpcr-for-detecting-infectious-diseases-and-biothreat-agents-in-the-field

總結

以上是生活随笔為你收集整理的【评测】TaqMan️探针和IDT PrimeTime️ 双淬灭探针的对比的全部內容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問題。

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