摘要

彌漫大B細胞淋巴瘤（DLBCL）是最常見的非霍奇金淋巴瘤亞型，是一種侵襲性淋巴瘤。雖然近年來一線的化療方案R-CHOP（利妥昔單抗、環磷酰胺、多柔比星、長春新堿和強的松）改善DLBCL患者的預后，但是仍有相當一部分的DLBCL患者因化療耐藥而出現進展或復發，這是困擾臨床治療的一大難題和挑戰。目前DLBCL患者出現化療耐藥和復發的機制仍然不清楚，值得我們進一步研究。已有研究發現利妥昔單抗耐藥與間充質干細胞相關，本研究將闡明DLBCL患者化療耐藥和復發間充質干細胞的關系，闡明其具體的機制，為臨床進一步解決DLBCL患者化療耐藥單核復發提供新的靶向治療的策略。
這篇文章主要采用CCK-8檢測細胞株（SU-DHL-2和SU-DHL-4）的增殖，克隆形成實驗檢測DLBCL細胞克隆形成能力，用異種移植小鼠來驗證DLBCL在體內的生長。分別用免疫組化、RT-PCR和ELISE法檢測白細胞介素（IL-6）和IL-17A在DLBCL細胞株共培養液或者腫瘤組織中的表達。用流式細胞術來分析Th17和Treg細胞的表達。使用蛋白印跡法、基因芯片分析和生物信息學分析IL-6和IL-17A介導的DLBCL生長的信號通路。以上的分析均采用SPSS進行統計分析。
研究結果表明：

人骨髓來源間充質干細胞（hBMSCs）在體外促進DLBCL細胞的生長，人外周血單個核細胞（PBMCs）會增強這種作用。hBMSCs顯著增加了SU-DHL-2和SU-DHL-4細胞的增殖和克隆形成能力；PBMCs顯著增加hBMSCs促進SU-DHL-2和SU-DHL-4細胞增殖和克隆形成能力的作用

hBMSCs分泌IL-6到上清液中，人DLBCL腫瘤組織中IL-6水平高于良性組織。

hBMSCs在體內分泌通過分泌IL-6促進DLBCL生長。小鼠的實驗中，MSC組合IL-6組的腫瘤體積明顯大于對照組；MSC組合IL-6組的IL-6 mRNA合蛋白質的水平明顯高于對照組

hBMSCs誘導PBMCs分化為Th17和Treg細胞，從而增加共培養上清液中IL-17A和轉錄生長因子β的水平。hBMSCs顯著增加了PBMCs中Th17和Treg細胞的比例，上調PBMCs中RORγt、FOXP3、IL17A和TGF-β mRNA的相對表達，增加共培養上清液中IL-17A和TGF-β蛋白的水平；包含BMSCs的共培養上清液中IL-6水平均顯著升高

hBMSCs或IL-6促進DLBCL細胞生長是通過保護其免受自發或藥物誘導的凋亡，而IL-17A則強化了這些作用。hBMSCs和外源性IL-6和IL-17A促進SU-DHL-4細胞的增殖，而aIL-6和aIL-17A則消除了這些作用；hBMSCs、IL-6或IL-17A降低了自發或利妥昔單抗誘導的SU-DHL-4細胞的凋亡，而aIL-6和aIL-17A則消除了這些作用。

IL-6或hBMSCs上調p-JAK2和p-STAT3激活JAK2/STAT3信號通路促進DLBCL細胞的生長。IL-6顯著促進SU-DHL-2和SU-DHL-4細胞中p-JAK2和p-STAT3，而aIL-6則消除了這些作用；同樣，同樣，hBMSCs上調了SU-DHL-4細胞中的p-JAK2和p-STAT3，而aIL-6消除了這些作用。

IL-17A上調細胞周期蛋白D2激活PI3K/Akt信號通路促進DLBCL細胞的生長。
綜上，hBMSCs有“雙重作用”，即分別通過直接分泌IL-6和間接提高IL-17A水平來促進DLBCL細胞的生長。

前言

介紹DLBCL：非霍奇金淋巴瘤是起源于淋巴結或其他淋巴組織的惡性腫瘤，近十幾年來其發病率不斷升高。彌漫大B細胞淋巴瘤是其中最常見的亞型，約占30%-40%，全世界范圍內一年發病率超過10萬例，是一種侵襲性淋巴瘤。根據不同的免疫表型，DLBCL分為兩種預后不同的基因亞型，分別是生發中心型（GCB型）和非生發中心型（non-GCB），其中Non-GCB型比GCB型預后差。雖然近些年以來的一線化療方案（R-CHOP）改善了DLBCL患者的預后，但是仍然有相當一部分患者因化療耐藥而出現進展或復發。有研究報道30%的DLBCL病例對利妥昔單抗或利妥昔單抗為基礎的化療方案耐藥，60%的以前對利妥昔單抗敏感的淋巴瘤病人再次接受治療時出現利妥昔單抗耐藥，這是困擾臨床治療的一大難題及挑戰。

介紹利妥昔單抗耐藥可能的機制：利妥昔單抗誘發細胞死亡的方式主要有：抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用、補體依賴性細胞毒性反應和直接凋亡信號。利妥昔單抗耐藥可能與腫瘤內在原因（如CD20表達缺失）或腫瘤微環境有關。有研究發現骨髓來源的間充質干細胞降低B細胞慢性淋巴細胞白血病（CLL）腫瘤細胞表面CD20的表達，從而引起對利妥昔單抗的耐藥，另外有研究發現PTEN/PI3K/Akt信號通路參加DLBCL的發展，同時可能參與利妥昔單抗耐藥的機制。但目前DLBCL患者出現化療（包括利妥昔單抗）耐藥和復發的機制仍不明確，值得我們進一步研究。

以前的觀點認為許多腫瘤對化療藥耐藥主要是由于腫瘤細胞的基因、表觀遺傳學或免疫表型突變引起的，但是現在越來越多的證據表明除了腫瘤本身的因素以外，腫瘤微環境的其他細胞，如間充質干細胞（MSCs）、免疫細胞（T、B和樹突狀細胞）等對于調節腫瘤細胞的生長和存活至關重要。這些細胞通過分泌細胞因子、趨化因子和其他分子來影響腫瘤的生長、發展和轉移。MSCs是近年來醫學和生物學鄰域最引人注目的熱點之一，是一群異質性成纖維細胞樣祖細胞，具有較強的自我更新和增殖、分化潛能。它可以從多種不同的組織中分離獲得，骨髓間充質干細胞（BMSCs）來源最豐富，且目前研究最廣泛。MSCs具有向炎性部位定向趨化的特性，之前有研究發現MSCs可以定向趨化并募集到受損的部位。惡性腫瘤實際上是一種永不愈合的損傷，而實際性腫瘤的微環境與受損組織的微環境極為相似，都含有大量的炎性細胞、炎性因子。研究表明，MSCs在T細胞淋巴瘤小鼠腫瘤模型中均具有向惡性腫瘤趨化的特性。越來越多的證據表明MSCs在腫瘤微環境中扮演“幫兇”角色。起促進腫瘤細胞生長、轉移，引起化療或放療的耐藥。在NHL中，多項研究證實了MSCs具有促進NHL生長，抑制NHL細胞凋亡以及引起化療耐藥的作用。Xu L等人通過體外實驗以及小鼠模型發現低氧促進人脂肪來源MSCs分泌IL-10激活JAK/STAT3信號通路從而促進伯基特淋巴瘤細胞生長，抑制細胞凋亡，增強腫瘤細胞“干性”和引起化療耐藥。另外多項研究均證明BMSCs激活BAFF/NF-κB通路從而抑制NHL細胞（包括DLBCL和MCL）凋亡，促進化療耐藥產生，其中Lwin T等共培養BMSCs和NHL細胞長達7個月，BMSCs持續作用于腫瘤細胞。Marquez ME等人證實了BMSCs降低B細胞CLL中腫瘤細胞表面CD20的表達，從而引起對利妥昔單抗的耐藥，有利用腫瘤細胞的生長。但是，與之相反，也有其他研究均表明不同來源的MSCs對不同病理類型的NHL起抑制作用。

IL-6的研究進展

Th17和Treg細胞的研究進展：naive CD4+ T cells在TGF-β和IL-6的共同作用下，經過STAT3通路活化ROR γ t分化為Th17細胞，Th17細胞分泌IL-17和IL-21等多種細胞因子，具有較強的促炎證炎癥的作用。初始CD4+ T cells在單獨TGF-β的作用下活化Foxp3而分化Treg細胞，Treg細胞分泌IL-10、IL-4和TGF-β，對效應T細胞具有抑制作用。

作者基于以上的研究背景，進行假設，①hBMSCs可能通過直接分泌IL-6促進DLBCL細胞生長、抑制凋亡并引起化療耐藥，可能作用的通路為IL-6/JAK2/STAT3或PI3K/Akt。②hBMSCs通過促進外周血單個核細胞（PBMCs）中Th17、Treg細胞的分化，間接上調腫瘤微環境中IL-17A水平，進一步協同DLBCL生長、抑制凋亡并引起化療耐藥。但具體的信號通路仍然需要進一步探索。在本研究中，我們通過體外共培養、CCK-8和克隆形成實驗等技術探討hBMSCs（加/不加PBMCs）在體外對DLBCL細胞株生長的影響；通過ELISA、免疫組化、流式細胞術、qPCR等技術探討和、hBMSCs在體外DLBCL細胞株共培養體系或患者DLBCL組織中是否分泌或影響IL-6、IL-17及其他相關的細胞因子、Th17細胞/Treg細胞水平；通過CCK-8和PI/Annexin V凋亡檢測等技術在體外驗證IL-6和IL-17協同抑制DLBCL細胞株或化療藥引起的細胞凋亡；通過基于芯片分析和生物信息學分析、WB和qPCR等技術探索IL-6和IL-17A促進DLBCL細胞株生長的具體信號通路；最后，構建SU-DHL-4細胞的異種移植小鼠模型，通過瘤體測量、qPCR、WB和免疫組化等技術探索hBMSCs對DLBCL細胞生長的影響及其對腫瘤微環境中IL-6的影響，以闡明DLBCL化療耐藥和復發的機制，為臨床進一步解決DLBCL化療耐藥和復發提供新的靶向治療的策略。

材料和方法

實驗試劑與材料

人體樣本和細胞株

人體病理組織樣本的收集

石蠟包埋的組織

DLBCL腫瘤組織的樣本

胃腸DLBCL 反應性增生的淋巴結的樣本

人體外周血單個核細胞樣本的收集與培養

①抽取健康志愿者外周血10ml（注意使用肝素抗凝管），然后用10mlPBS稀釋。
②15ml離心管中加入5ml的淋巴細胞分離液，然后將稀釋后的血樣品平鋪到分離液上方，注意動作輕柔，兩界面應清晰，三者等比例體積分布
③室溫，水平轉子700-800g，離心20-30min
④離心結束以后，管底是紅細胞，中間層是分離液，最上層是血漿/組織勻漿層，血漿層與分離液層之間是一層致密的白膜，即單個核細胞層。吸取白膜層到15ml的離心管中，然后用PBS稀釋以后混勻（白膜層：pbs=1:3）,室溫下離心（水平轉子250g，10min）
⑤棄上清，5mlPBS或細胞清洗液重懸細胞，250g，離心10min
⑥重復步驟⑤
⑦棄上清，細胞重懸備用。

DLBCL細胞株的培養、傳代和凍存

①本研究所用的DLBCL細胞株為購買自ATCC（上海，中國）的SU-DHL-2和SU-DHL-4細胞株，它們的培養基為RPMI-1640培養基+10%胎牛血清+1%雙抗（Gibco）。具體的復蘇、傳代、凍存的步驟如下：
②細胞復蘇：將凍存細胞從液氮或干冰箱中取出后，在37°水浴鍋內不斷搖動促進其融化。移入15ml離心管中，加入10ml預熱地RPMI-1640完全培養基，輕輕吹打混勻，離心，2000rpm 2min，棄上清，加入10ml RPMI1640完全培養基清洗，棄上清液體，加入10ml RPMI 1640完全培養基，輕輕吹打，接種于10cm盤中，在含有5%CO₂的細胞培養箱中培養。
③細胞傳代:細胞密度達到80%-90%時候，轉移到15ml的離心管，2000rpm 2min，棄上清。再加入10mlPBS懸浮細胞，2000rpm 2min離心，棄上清液。再加入10mlPBS，吹勻，吸取10μl進行計數，按照100萬/盤進行接種，在含有5%5%CO₂的細胞培養箱中繼續培養。
③細胞凍存：當細胞密度達到80%-90%時，轉移到15ml離心管，2000rpm 2min，棄上清，加1ml凍存液（90%FBS，10%DMSO），放入凍存盒（內盒有異丙醇，以保證溫度降低的速度），立即放入-80°冰箱內，過夜，第二天放入液氮中，可以至少保存兩年，如不放入液氮中，可以保存三個月。凍存液的配置：70%完全培養基+20%FBS+10%DMSO，DMSO需要慢慢滴加，邊滴加邊搖。

體外細胞共培養:作者采用總共四個體外細胞共培養實驗，在所有的共培養的實驗中，SU-DHL-2/SU-DHL-4細胞和PBMCs的細胞濃度均為1X10₆個/孔。具體細胞培養的方案如下：

①SU-DHL-2或SU-DHL-4細胞分別單獨培養或與hBMSCs以三種不同的比例1：1、1：5和1：0.2共培養72h，培養方式分別為直接培養和間接培養兩種方式，間接培養使用Transwell小室（康寧，美國）。培養時間到后收集SU-DH-2或SU-DHL-4細胞進行CCK-8細胞增殖分析，收集上清液進行ELISA檢測相關細胞因子水平。
②先按以下分組將SU-DHL-2或SU-DHL-4細胞、PBMCs和hBMSCs按1:1:1的比例在6孔板中共培養，并使用transwell小室。SU-DHL-2單獨；SU-DHL-2+hBMSCs；SU-DHL-2+PBMCs+hBMSCs；SU-DHL-4單獨；SU-DHL-4+hBMSCs；SU-DHL-4+PBMCs+hBMSCs；其中SU-DHL-2或SU-DHL-4細胞置于小室中，其他細胞置于小室外。所有分組均培養72h，然后收集SU-DHL-2或SU-DHL-4細胞使用CCK-8檢測細胞增殖率和使用克隆形成實驗檢測SU-DHL-2或SU-DHL-4細胞克隆形成能力，收集各組上清液檢測相關細胞因子水平。
③先按以下分組將SU-DHL-2或SU-DHL-4細胞、PBMCs和hBMSCs按1:1;1的比例共培養72h，并使用Transwell小室。
PBMSc單獨；PBMCs+hBMSCs；PBMCs+SU-DHL-2；PBMCs+SU-DHL-2+hBMSCs；PBMSc+SU-DHL-4；PBMCs+SU-DHL-4+hBMSCs。培養后，收集各組PBMCs用流式細胞術檢測Th17和Treg細胞比例，用qPCR檢測PBMCs中相關轉錄因子及細胞因子的水平，另收集各組培養上清液用ELISA法檢測各種相關細胞因子水平。
④先按以下分組分為總共11組共培養組：
SU-DHL-4;SU-DHL-4+hBMCs；SU-DHL-4+hBMSCs+aIL-6；SU-DHL-4+IL6；SU-DHL-4+IL-6+aIL-6；SU-DHL-4+IL17；SU-DHL-4+IL17+aIL-17；SU-DHL-4+IL-6+IL-17；SU-DHL-4+IL-6+IL-17+aIL6；SU-DHL-4+IL-6+IL-17+aIL-17；SU-DHL-4+IL-6+IL7+aIL-6+aIL-17。其中細胞因子的濃度為IL-6（0.5ng/ml），aIL-6（50μg/ml），IL-17A（0.1ng/ml）and/or aIL-17A（10μg/ml），SU-DHL-4和hBMSCs的比例為1：1，總共培養72h。rituximab（10μg/ml），doxorubicin（2μM）和Ara-C（2μM）在SU-DHL-2細胞凋亡檢測前24h分別加入。然后SU-DHL-2/SU-DHL-4細胞收集后用CCK-8和PI/Annexin V檢測其細胞增殖和凋亡。

細胞增殖率和克隆形成實驗

SU-DHL-2/SU-DHL-4細胞的增殖率使用CCK-8法檢測，克隆形成能力用克隆形成實驗檢測。

軟瓊脂克隆形成實驗

①配制100ml的1.2%Argrose和0.7%Argrose，Argrose用DNA電泳用BIOWEST REGULAR Argrose G10（4°），溶劑用雙蒸水，高壓滅菌以后，維持在42°中不會凝固。配置500ml 2X1640和0.0005%的結晶紫。
②實驗前，將水浴鍋放入超凈臺內，紫外照射，設定穩定為42°。提前融化好血清和雙抗。
③如已制好上下膠，則在微波爐中溶解1.2% Argrose下膠和0.7%Argrose上膠，降溫以后放入42°水浴鍋中保持。。
④根據實驗需要的量配置20%FBS+2X1640+2XPS（5種細胞配40ml），每一種細胞設置三個復孔。
⑤鋪下膠：按1：1的比例使1.2%Argrose下膠合20%FBS+2X1640+2XPS混合，6孔板每孔迅速加入1.5ml的混合液，輕輕混勻，室溫靜置待下膠凝固（加混合液時不能產生氣泡）。對于一個六孔板，配5ml上訴培養液+5ml 1.2% Argrose下膠于50ml離心管中（離心管一直置于水浴鍋內）
⑥細胞計數：取生長期細胞，用0.25%胰蛋白酶消化并輕輕吹打，使之成為單細胞，作活細胞計數，用正常培養液調整細胞密度為4010⁴/ml以上，這樣家的體積小于100μl，不會影響其他成分的稀釋成都。每孔鋪110⁴/ml，準備四個孔的細胞數，即410⁴。
⑦鋪上膠：按1：1比例混合0.7%Argrose上膠和20%FBS+2X1640+2XPS，每一種細胞需先配置2ml（20%FBS+2X1640+2XPS）+2ml 0.7%Argrose上膠于離心管中混勻，放入42°水浴鍋中保持。再將細胞懸液加入上述的混合溶液中，混勻以后迅速加入六孔板中，每孔1ml。待上層瓊脂凝固以后，置于5%CO2，37°培養2-3周。
⑧間隔兩天補充200μl 10%FBS+1640+1XPS，以防過于干燥。
⑨計數克隆：把平皿放置再倒置顯微鏡下（100X），在鏡下隨機選擇10個視野，計數視野中大于50個克隆數（>0.05mm的克隆）和所有克隆，克隆形成率=大于50個克隆數\所有克隆數100%。每孔加入1ml的0.005%的結晶紫染色1h以上，鏡下拍照。
⑩數據處理：每一個視野是1mm²,六孔板每孔的面積是9.6cm²,則一個孔中總克隆數=平均克隆數*960，如果要比較>0.05mm的克隆的絕對值，則可以利用每孔.0.05mm的克隆數/每孔總克隆數，將分母取一組作為標準，做出此組與其他組的比值系數，再分別用此系數乘以各組>0.05mm克隆數的絕對值，可進行比較。

CCK-8實驗

①在96孔板中接種細胞懸液==（100μl/孔）？==。將培養板放在培養箱預培養（37度。5%CO₂）。并設置空白組（等量培養液）以及對照組（單純T淋巴細胞培養）。常規培養過夜。
②向每一孔中加入10μl的CCK-8溶液（注意不要在孔中生成氣泡，它們會影響OD值得讀數）。
③將培養板在孵箱中孵育4h。
④用酶標儀（Thermo Fisher Scientific，Inc.，Waltham，MA，USA）測定在450nm處吸光度。
⑤計算細胞增殖率，公式為：細胞增殖率=[A（實驗組）-A（空白組）]/[A(對照組)-A（空白組）]

免疫組化

本研究中使用免疫組織化學方法（IHC）檢測48例人腫瘤組織、18例良性組織和24例小鼠組織中IL-6表達水平。實驗步驟如下：

①組織用10%中性甲醛固定，石蠟包埋，石蠟包埋組織被連續切割為4μm的切片，拷片：68°，20min。
②常規二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水：二甲苯Ⅰ 20min?二甲苯Ⅱ 20min?100%酒精10min?100%酒精10min?95%酒精5min?80%酒精5min?75%酒精5min
③阻斷內源性過氧化物酶：3%H2O2 37°孵育10min，PBS沖洗3X5min
④抗原修復：置于0.01M枸櫞酸緩沖液中修復（PH=6.0）中煮沸（95°，15min-20min），自然冷卻到室溫，再用雙蒸水洗。
⑤正常羊血清工作液封閉，37° 10min，傾去勿洗。
⑥滴加一抗4°冰箱孵育過夜，PBS洗3X5min（用PBS緩沖液代替一抗作陰性對照）；滴加生物素標記二抗，37°孵育30min，PBS洗3X5min。
⑦滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素工作也，37°孵育30min，PBS洗3X5min。
⑧DAB顯色，自來水終止，蘇木素復染，常規脫水，透明，干燥，封片。
⑨用相對積分光密度（IOD）定量測量石蠟切片中IL-6的表達，在40X的高倍鏡下至少采集三幅不同石蠟切片的圖像，有經驗豐富的病理學家利用Image Pro Plus 6.0計算石蠟切片的圖像IOD和平均IOD。以平均IOD最低的石蠟片作為陰性對照，計算相對IOD的公式為平均IOD/陰性對照。

實時熒光定量PCR

根據制造商的要求，使用TRIZOL試劑從SU-DHL-2細胞,PBMCs細胞或小鼠腫瘤組織中分離出總RNA。根據制造商的要求，使用Primescript RT Master Mix（Takara）將RNA反向逆轉到cDNA上。

蛋白印跡分析（Western Blot）

簡單的蛋白印跡實驗歸結如下：使用蛋白酶抑制劑（Roche）的十二烷基硫酸鈉緩沖液溶解SU-DHL-2或SU-DHL-4細胞或腫瘤組織。通過10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離出等量的蛋白質，并轉移到聚偏二氟乙烯膜上，在4°下使用特異性的抗體封閉過夜。所用抗體為JAK2，p-JAK2，STAT3，p-Akt，Akt，cyclin D2，P27，IL-6以及GAPDH。然后用辣根過氧化物酶標記的二抗培養膜，用增強化學發光試劑觀察蛋白條帶。

流式細胞術

本研究采用流式細胞術檢測Th17細胞和Treg細胞的比例，簡單的實驗步驟歸結為：首先，將細胞密度調整為2*10⁶個/ml。對于Th17細胞，在37°和5%CO₂條件下，在培養基中加入50ng/ml的佛波脂、1μg/ml的離子霉素和10μg/ml的Brefeldin A，刺激細胞5h。然后在室溫下用抗CD4-FITC和抗IL-17A-APC抗體對細胞進行1h染色，在室溫下，用抗CD4-FITC、抗Foxp3-PE和抗CD25-APC抗體對Treg細胞進行分析，并用Flowjo 10軟件對數據進行分析。CD4+IL-17A+細胞被定義為Th17細胞，CD4+CD25+Foxp3+細胞被定義為Treg細胞。

酶聯免疫吸附實驗

在指定時間收各實驗方案中各組培養上清液，然后按照IL-17A、IL-6、IL-10、IL-1β、PGE2和TGF-β的ELISA試劑盒說明書進行測定，用多功能微孔板分析儀測出各血清吸光度（A）值，通過繪制標準曲線計算出各細胞中細胞因子的濃度，評估上清液中的。下面以IL-17A為例說明ELISA的操作步驟。
自備材料
450nm波長的酶標儀
加樣槍
自動洗板機
坐標紙
計時器
震蕩器
標本的收集和處理：
標本應當清晰并避免溶血。如果允許的話，未知標準應當進行一系列的稀釋以確定最佳稀釋度類保證測定的質量。
血清：使用血清分離管，允許凝固時間至少為30min，然后離心1000g 10min。分離血清層并立即分析，或者血清標本保存在＜-70°，并避免反復凍融。

試劑盒樣品的準備
①將20倍濃縮洗液稀釋至1X。例如，配1L 1X 洗液，應當在950ml去離子水加入50ml的濃縮液。
②復溶Human IL-17A Standard，按照Human IL-17A Standard小瓶標簽的說明，在小瓶里加入一定體積的Assay Buffer A，使之成為20ng/ml的標準原液，輕柔混勻。將復溶的標準原液在室溫下放置15min，vortex再次徹底混勻
③一般情況下，分析樣本不需要稀釋，如果需要稀釋的話使用Assay Buffer A。
操作程序
①使用前將所有試劑恢復至室溫。強烈建議所有標準及樣品應當雙份或三份，每一次分析都需要一條標準曲線。
②將6.25μl標準原液加入到493.75μl的Assay Buffer A當中，成為500μl的250pg/ml的top標準，將250pg/ml的top進行六次倍比稀釋。分別得到IL-17A的系列標準，250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、31.3pg/ml、15.6pg/ml、7.8pg/ml和3.9pg/ml。Assay Buffer A作為0pg/ml。

③洗板：使用至少300μl 1X洗液洗板4次，在吸水紙上盡力拍干。后來每一次的洗板液量都盡量相同。
④加Assay Buffer A：每孔加50μl的Assay Buffer A（標準液和樣本均需要）。
⑤加樣：每孔加50μl標準液或樣品
⑥孵育：用試劑盒提供的密封膜將板密封，在室溫下200rpm震蕩2h
⑦洗板：棄去孔內容物，洗板4次，同步驟3
⑧加抗體：每孔加100μl的Human Detection Antibody。密封，室溫震蕩1h。
⑨洗板：棄去內容物，洗板4次，同步驟3
⑩加酶：每孔加100μl Avidin-HRPD。密封，室溫震蕩30min。
(11)洗板：棄去內容物，洗板5次，同步驟3.對于最后一次洗板，用1X 洗液浸泡每孔30s至1min，這樣能減小背景。
(12)顯色：每孔加100μl Substrate Solution F，在黑暗中孵育30min。高含量的IL-17A孔會變成藍色。此步無需密封。
(13)停止反應：每孔加入100μl的stop Solution。藍色會變成黃色。
(14)讀OD值：在30min內用450nm的波長讀取OD值，如果能夠讀570nm，570nm下的吸收率會少于450nm下的吸收率。

細胞凋亡的檢測

采用Annexin V/propidium iodide的法檢測DLBCL細胞凋亡。將細胞接種于48孔培養板上，用/不用化療藥物培養72h，培養以后用冷的PBS洗滌兩次，再懸浮于濃度為1*10⁶細胞/ml的結合緩沖液中，100μl的溶液轉移到5ml的試管中，加入5μl Annexin V-FITC和5μl的propidium iodide。試管輕輕的旋轉，在室溫下在黑暗中國孵育15min。培養結束時，加入300μl的結合緩沖液。立即用流式細胞儀進行流式細胞分析。

人類基因表達譜分析以及生物信息學的分析

SU-DHL-2（2*10⁶細胞/ml）與IL-17A（100pg/ml）共培養72h，后被收集起來。用TRIZOL試劑提取每一個樣品的總RNA，測定RNA表達譜，篩選DEGs

異種移植小鼠模型

實驗采用雄性裸鼠（BALB/c，20-30g）6-8周齡。在干凈的條件下，將小鼠安置在微型的隔離籠中進行檢測。所有實驗程序和方案均獲得廣州市第一人民醫院動物管理和使用委員會的批準。將SU-DHL-4細胞（110⁷cells/100μl PBS）皮下接種于裸鼠右側翼，3mm直徑腫瘤發生以后將小鼠隨機分為三組（每一組8只）。MSC組（510⁵細胞/100μl PBS）；IL-6組（10μg/kg/次）；對照組（100μl/次）。所有組每三天注射一次，總共5次（第0、3、6、9、12）.每3天測量一次腫瘤大小，直到注射hBMSCs、IL-6和PBS后28天。腫瘤體積按照以下公式進行計算：腫瘤體積（mm³）=(a²b)/2,其中a代表短軸的長度，b代表長軸的長度。在hBMSCs\IL-6和PBS注射后28天處死小鼠，切除腫瘤并制備IHC，qPCR和WB分析。

統計分析

對于基因芯片分析來說，使用p值閾值和FDR確定DEGs，以及p<0.05和FDR<0.05.所有的分析均采用SPSS 17.0來進行。計量的資料表示平均值±標準差。采用Two-tailed independent-sample Student’s t/t來進行兩組之間的比較。單因素方差的分析和Student-Newman-Keuls/Dunnett’s T3檢驗（每兩組之間）用于多組之間的比較?？ǚ綑z驗用于檢驗兩組之間的計數資料比較，p<0.05被認為是差異有顯著。

實驗結果

hBMSCs在體外促進DLBCL細胞的生長，而PBMCs則增強這些作用。

為了研究hBMSCs在體外是否促進DLBCL細胞的生長，將hBMSCs與SU-DHL-2或SU-DHL-4細胞以不同比例在直接或間接的體系中共培養72h，然后在不同的時間點用CCK-8檢測SU-DHL-2和SU-DHL-4細胞的h BMSCs在直接（圖1A-C）或間接（圖1D-F）共培養系統中

hBMSCs分泌IL-6到共培養的上清液中，人DLBCL腫瘤組織中的IL-6水平高于良性組織。

hBMSCs通過分泌可溶性細胞因子來促進DLBCL細胞的生長，因此，我們嘗試鑒定這些細胞因子。

實驗結果表明，h BMSCs與SU-DHL-2和SU-DHL-4細胞共培養時，以時間依賴的方式顯著地分泌IL-6到共培養上清液中（圖2A和B）；此外，hBMSCs在直接或間接共培養系統中以不同的比例顯著地分泌IL-6（圖2C和D）。

HBMSCs組的PGE2水平在不同比率下降低（圖2E和F）

兩組間的IL-10、IL-17A、TGF-β和IL-1β水平無差異

IHC法分別檢測了人腫瘤組織和良性組織中IL-6的相對表達。腫瘤組織中的IL-6水平明顯高于良性組織（圖2 O和P）

hBMSCs在體內通過分泌IL-6促進DLBCL生長

DLBCL異種移植BALB/c裸鼠模型

MSC和IL-6組的腫瘤體積明顯大于對照組（圖3B）

MSC組和IL-6組的IL-6 mRNA和蛋白質水平明顯高于對照組

IHC染色發現MSC組和IL-6組腫瘤組織中的IL-6水平高于對照組

hBMSCs誘導PBMCs分化為Th17和Treg細胞，從而增加上清液中的IL-17A和TGF-β水平。

分別用hBMSCs、PBMCs或DLBCL細胞株組成的8組共培養72h

Transwell小室分離細胞，用FACS和qPCR檢測6組共培養中的PBMCs

用ELISA檢測8組共培養中的上清液

在有或無h BMSCs的情況下，三個配對組的比較顯示，h BMSCs顯著增加了每配對組PBMCs中Th17和Treg細胞

在轉錄水平，當與PBMCs或DLBCL細胞系共培養時，hBMSCs上調了PBMCs中RORγt和Foxp3的相對表達

hBMSCs上調了PBMCs中的IL-17A和TGF-β的相對表達-轉錄水平

hBMSCs增加了共培養上清液中IL-17A和TGF-β蛋白的水平

hBMSCs組的共培養上清液中IL-6水平均顯著升高

表明由h BMSCs分泌到上清液中的IL-6誘導PBMCs分化為Th17細胞

高TGF-β水平誘導Treg細胞分化

hBMSCs或IL-6促進DLBLC細胞生長是通過保護其免受自發或藥物誘導的凋亡，而IL-17A則強化了這些作用。

IL-6或IL-17A在套細胞淋巴瘤或DLBCL中起著促腫瘤因子的作用

假設h BMSCs分泌IL-6到DLBCL的腫瘤微環境中，而IL-6直接促進DLBCL的生長，并且誘導Th17細胞分泌IL-17A，從而增加了這種促進作用。

h BMSCs和外源性IL-6和IL-17A促進了SU-DHL-4細胞的增殖，而aIL-6或aIL-17A則消除了這些作用

IL-17A增加了IL-6的促進作用，而aIL-6和aIL-17A聯合使用則消除了這些作用

外源性IL-6和/或IL-17A對DLBCL細胞自發或藥物誘導凋亡的影響

外源性IL-6或IL-17A以濃度遞增方式加入SU-DHL-2或SU-DHL-4細胞中共培養48h，隨后在用FACS檢測細胞凋亡前使用利妥昔單抗治療24h

IL-6或IL-17A以濃度依賴性方式顯著地保護SU-DHL-2或SU-DHL-4細胞免受利妥昔
單抗誘導的凋亡。

研究了IL-6和IL-17A對SU-DHL-2細胞抗利妥昔單抗、阿霉素和Ara-C誘導的凋亡的保護作用。如圖5D所示，IL-6顯著降低了三組凋亡細胞的百分比，而IL-17A進一步增強了這些作用。

進一步證實IL-6和/或IL-17A對DLBCL細胞凋亡的影響，我們采用IL-6
和/或IL-17A中和抗體阻斷IL-6和IL-17A介導的信號傳導

hBMSCs、IL-6或IL-17A降低了自發或利妥昔單抗誘導的SU-DHL-4細胞凋亡，而aIL-6或aIL-17A則消除了這些作用

IL-17A可以增強IL-6的保護作用，而aIL-6和aIL-17A一起可以消除這些作用

IL-6/hBMSCs上調p-JAK2和p-STAT3激活JAK2/STAT3信號通路促進DLBCL細胞生長。

顯著促進SU-DHL-2和SU-DHL-4細胞中JAK2和STAT3的磷酸化

hBMSCs上調了SU-DHL-4細胞中的p-JAK2和p-STAT3

IL-17A上調細胞周期蛋白D2激活PI3K/Akt信號通路促進DLBLC細胞生長

進一步研究IL-17A介導的DLBCL細胞生長的分子機制，我們結合qPCR、western blotting和基因芯片、生物信息學分析一起，以評估相關基因和蛋白質的表達

SU-DHL-2細胞樣本與IL-17A共培養72小時，另外三個沒有IL-17A的樣本作為對照.

288個DEGs（139個上調，149個下調）

所有上調的DEGs中的前10個最豐富的生物過程GO條款為 positive
regulation of cyclin-dependent protein serine/threonine kinase activity、positive
regulation of cyclin-dependent protein kinase activity、regulation of cyclin-dependent
protein serine/threonine kinase activity

上述其中三個條款與細胞周期調節有關，參與上調的DEGs分別為PKD1、CDKN1B和CCND2

下調的DEGs中的最豐富途徑包括Ras信號通路和p53信號通路

上調DEGs中的最豐富途徑包括PI3K/Akt信號通路、Rap1信號通路、前列腺癌和腫瘤microRNAs

PI3K/Akt信號通路（8個相關基因：CCND2、CDKN1B、CSF1、EFNA3、FGFR2、FGFR3、IL2RB和ITGA9）在上調的通路中排名第一

STRING數據庫和Cytoscape 3.6.0軟件生成所有相互作用的DEGs的共表達網絡，以識別可能在IL-17A介導的SU-DHL-2細胞生長中起重要作用的基因
10.qPCR檢測8個基因的m RNA表達，用western blotting檢測PI3K/Akt通路相關蛋白的表達。與基因芯片結果一致，IL-17A處理的SU-DHL-2細胞的CSF1、CCND2、EFNA3、FGFR2、FGFR3、IL2RB和ITGA9的相對mRNA表達顯著較高。IL-17A上調了SU-DHL-2細胞中p-Akt和cyclin D2的表達，而aIL-17A則消除了這些影響

IL-17A通過激活PI3K/Akt信號，通過上調cyclin D2，促進了SU-DHL-2細胞的生長

總結

以上是生活随笔為你收集整理的学位论文精读-hBMSCs在肿瘤微环境中分泌IL-6并上调IL-17水平协同促进DLBCL生长的研究的全部內容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問題。

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