【评价】Integrated DNA Technologies公司基因编辑技术
美國(guó)Integrated DNA Technologies公司（簡(jiǎn)稱IDT），總部位于美國(guó)愛(ài)荷華州科勒爾維爾，成立于 1987年，是基因組學(xué)領(lǐng)域開(kāi)發(fā)的領(lǐng)先者，也是公認(rèn)的定制核酸生產(chǎn)行業(yè)的領(lǐng)導(dǎo)者。
IDT 憑借在 DNA 合成領(lǐng)域的領(lǐng)導(dǎo)能力，為基因組學(xué)應(yīng)用開(kāi)發(fā)了專(zhuān)有技術(shù)，例如下一代測(cè)序、CRISPR 基因組編輯、合成生物學(xué)、數(shù)字 PCR 和 RNA 干擾。通過(guò) GMP 服務(wù)，IDT的產(chǎn)品被科學(xué)家用于研究多種癌癥以及大多數(shù)遺傳性和傳染性疾病。
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IDT為100多個(gè)國(guó)家和地區(qū)的超過(guò)120,000名生命科學(xué)研究人員提供服務(wù)，每天生產(chǎn)70,000多條核酸產(chǎn)品。
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2020年11月3日，北京澤平科技與美國(guó)Integrated DNA Technologies（以下簡(jiǎn)稱”IDT”）達(dá)成戰(zhàn)略合作。澤平科技成為美國(guó)Integrated DNA Technologies公司代理商。根據(jù)協(xié)議，澤平科技將代理銷(xiāo)售IDT公司CRISPR基因組編輯等板塊的產(chǎn)品及業(yè)務(wù)。
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關(guān)于Alt-R? CRISPR 基因編輯系統(tǒng)
IDT公司 Alt-R? CRISPR 基因編輯系統(tǒng)。該系統(tǒng)主要采取的轉(zhuǎn)化核糖蛋白復(fù)合物（Ribonucleoprotein complex，RNP）的方法，RNP 即 Cas9 蛋白和 gRNA 結(jié)合形成的具有編輯功能的復(fù)合物。
IDT公司 Alt-R? CRISPR 基因編輯系統(tǒng)。該系統(tǒng)主要采取的轉(zhuǎn)化核糖蛋白復(fù)合物（Ribonucleoprotein complex，RNP）的方法，RNP 即 Cas9 蛋白和 gRNA 結(jié)合形成的具有編輯功能的復(fù)合物。
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3 步組裝「分子改造器」：
Alt-R? CRISPR 系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)操作只需 3 步，就像把大象放進(jìn)冰箱一樣簡(jiǎn)單！
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IDT Alt-R? CRISPR/Cas9 實(shí)驗(yàn)流程
IDT 同時(shí)也提供針對(duì)不同模式生物的 protocol，相信總有一款適合你！
IDT Alt-R? CRISPR 相關(guān)實(shí)驗(yàn)流程
優(yōu)化的「螺紋釘」
在 IDT Alt-R? CRISPR 系統(tǒng)中，組成「螺紋釘」gRNA 的「零件」crRNA 和 tracrRNA 均經(jīng)過(guò)了特殊優(yōu)化。天然 tracrRNA 較長(zhǎng)，含 89 個(gè)堿基，合成復(fù)雜且費(fèi)用較高。優(yōu)化后的 67 個(gè)堿基的通用型 tracrRNA，可與特異的 crRNA 在體外結(jié)合形成 gRNA。36 個(gè)堿基的 crRNA 包括結(jié)合靶序列的結(jié)構(gòu)域（含 20 個(gè)堿基）和結(jié)合 tracrRNA 的結(jié)合域（含 16 個(gè)堿基）。
IDT 通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明 36 堿基的 crRNA 和 67 堿基的 tracrRNA 組合效率最高。且二者均添加了特殊化學(xué)修飾，可使 gRNA 具有核酸酶抗性。為便于追蹤和篩選被成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，可在 tracrRNA 中添加熒光基團(tuán)修飾。
你只需要提供符合要求的 20 個(gè)堿基靶序列即可下單 crRNA，搭配 IDT 公司的通用 tracrRNA 和 Cas9 蛋白，只需要稍加組裝，即可成為直入基因組靶區(qū)腹地的神器。
不過(guò)值得一提的是，與其他 CRISPR/Cas9 方式相比，RNP 的細(xì)胞毒性低、不易引起免疫反應(yīng)，且在體外即可對(duì) DNA 片段進(jìn)行切割，便于在預(yù)實(shí)驗(yàn)中初步驗(yàn)證「分子改造器」的效率。
IDT Alt-R? CRISPR/Cas9 系統(tǒng)組成:
利用 Alt-R CRISPR-Cas9 系統(tǒng)陽(yáng)性對(duì)照crRNA組成的RNP在體外對(duì)柱純化 Hs HPRT 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行編輯。
體外基因編輯的體系為 10 μL，Sample1 為對(duì)照組，只含 Hs HPRT 基因編輯模板不含RNP；Sample 2 包含模板和 RNP。隨后利用片段分析儀進(jìn)行編輯效率分析。
如圖所示，IDT 在線工具提供針對(duì)人、大鼠、小鼠、斑馬魚(yú)、線蟲(chóng)等多種模式生物的預(yù)設(shè)計(jì) crRNA 序列庫(kù)。用戶只需選擇物種和輸入基因名即可獲取預(yù)設(shè)計(jì)位點(diǎn)。
IDT crRNA 在線設(shè)計(jì)工具
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如果預(yù)設(shè)計(jì)庫(kù)中沒(méi)有針對(duì)靶目標(biāo)的「螺紋釘」，你可以輸入 Fasta 序列進(jìn)行定制設(shè)計(jì)并利用在線「crRNA 檢查器」（CRISPR-Cas9 crRNA Checker）排查潛在的脫靶位點(diǎn)。IDT 在線工具凝結(jié)了很多科學(xué)家實(shí)踐多年的心血，在設(shè)計(jì)層面充分把控了脫靶風(fēng)險(xiǎn)。
降低脫靶率的「扳手」
干細(xì)胞移植專(zhuān)家，美國(guó)斯坦福大學(xué),馬修?波特斯（Matthew Porteus）博士說(shuō)：
“人類(lèi)干細(xì)胞上的測(cè)試結(jié)果表明，與其他高保真 Cas9 酶比，IDT 的 Alt-R? S.P. HIFI Cas9 呈現(xiàn)出穩(wěn)定的中靶編輯活性，脫靶率又極低。我們被這個(gè)高保真的 Cas9 酶的表現(xiàn)所折服，已在使用它來(lái)開(kāi)發(fā)基于基因編輯的疾病治療方案。”
波特斯博士所提的在人類(lèi)干細(xì)胞測(cè)試中勝出的高保真 Cas9 酶，為 IDT 科學(xué)家通過(guò)對(duì) 250 000 個(gè) Cas9 突變體篩選后，優(yōu)化出的 Alt-R? S.P. HIFI Cas9 酶。眾所周知，CRISPR 基因編輯的脫靶效應(yīng)是其作為醫(yī)療用途的潛在隱患。而Alt-R? S.P. HIFI Cas9 蛋白則特別適合脫靶效應(yīng)敏感的應(yīng)用環(huán)境該酶使 CRISPR 系統(tǒng)成為更精確的基因組編輯工具。
如下圖所示，Alt- R? HIFI Cas9 蛋白與 Kleinstiver 等人發(fā)表的 SpCas9-HF1 （Kleinstiver et al., Nature 529:490-495）以及 Slaymaker 等人發(fā)表的 eSpCas9（Slaymaker et al., Science 351:84-88）在脫靶率上的表現(xiàn)高度一致：即相比普通的野生型 Alt-R? S.P. Cas9 蛋白，對(duì) EMX1，HEKSite4 或 VEGFA3 基因編輯的脫靶效應(yīng)顯著降低；同時(shí)，Alt-R? HIFI Cas9 蛋白的有效切割效率與野生型接近。
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Alt-R? S.P. HIFI Cas9 可保證靶向編輯效率的同時(shí)又無(wú)脫靶現(xiàn)象
Alt- R 普通野生型 Cas9 （深藍(lán)色）、Alt-R HIFI Cas9 （橙色）、SpCas9-HF1 （淺藍(lán)色）、eSpCas9（灰色）4 種蛋白分別與靶向 EMX1，HEKSite4 或 VEGFA3 基因的 Alt-R gRNA 結(jié)合形成 1 μM RNP復(fù)合物。利用 Lipofectamine RNAi MAX 轉(zhuǎn)染試劑將 10 nM 的 RNP 分別轉(zhuǎn)染到 HEK-293 細(xì)胞系。48 小時(shí)后提取基因組 DNA 進(jìn)行切割率分析。
目前，IDT Alt-R? CRISPR 系統(tǒng)及 Alt-R? S.P. HIFI Cas9 酶的優(yōu)越性已得到許多實(shí)驗(yàn)室的認(rèn)可，廣泛應(yīng)用于各種細(xì)胞、小鼠、斑馬魚(yú)、植物等系統(tǒng)中。
另外，IDT 還提供 Alt-R? CRISPR-Cas12a (CPF1)系統(tǒng) ，為不能被CRISPR-Cas9 體系編輯的區(qū)域提供新的 CRISPR 目標(biāo)位點(diǎn)。該系統(tǒng)中，Alt-R? A.s. Cas12a (Cpf1) 酶可識(shí)別 PAM 序列 TTTV。該系統(tǒng)使在生物體內(nèi)編輯富含 AT 堿基區(qū)域的基因組成為可能。
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IDT Alt-R? CRISPR-Cas12a 系統(tǒng)組成
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IDT Alt-R? CRISPR 系統(tǒng)被多篇發(fā)表在高質(zhì)量期刊的文獻(xiàn)所引用
部分使用 IDT Alt-R? CRISPR 發(fā)表在 Nature、Neuron 等期刊上的文章：
Riddle MR, Aspiras AC, et al. (2018) Insulin resistance in cavefish as an adaptation to a nutrient-limited environment. Nature, 555 : 647–651.
Luo L, Bokil N, et al.. (2017) SCIMP is a transmembrane non-TIR TLR adaptor that promotes proinflammatory cytokine production from macrophages . Nat Commun, 8 : 14133.
Agudelo D, Duringer A, et al.. (2017) Marker-free coselection for CRISPR-driven genome editing in human cells. Nature Methods, 14 :615–620.
Mikheikin A, Olsen A, et al. (2017) DNA nanomapping using CRISPR-Cas9 as a programmable nanoparticle. Nat Commun, 8 : 1665.
Kohler S, Wojcik M, et al.. (2017) Superresolution microscopy reveals the three-dimensional organization of meiotic chromosome axes in intact Caenorhabditis elegans tissue . Proc Natl Acad Sci USA, 114 : E4734–E4743.
Seki A, Rutz S. (2018) Optimized RNP transfection for highly efficient CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in primary T cells. J Exp Med. doi: 10.1084/jem.20171626
Quadros RM, Miura H, et al. (2017) Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins . Genome Biology, 18 : 92.
Han X, Liu Z, et al. (2017) Cas9 ribonucleoprotein delivery via microfluidic cell-deformation chip for human T-Cell genome editing and immunotherapy . Adv Biosys, 1 : 1600007.
Andersson M, Turesson H, et al. (2018) Genome editing in potato via CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein delivery. Physiol Plant. doi: 10.1111/ppl.12731
Brinkman EK, Kousholt AN, et al. (2018) Easy quantification of template-directed CRISPR/Cas9 editing. Nucleic Acids Res. doi: 10.1093/nar/gky164
Kim KW, Tang NH, et al. (2018) A neuronal piRNA pathway inhibits axon regeneration in C. elegans. Neuron, 97 : 1–9.
Al Abdallah Q, Ge W, Fortwendel JR. (2017) A simple and universal system for gene manipulation in Aspergillus fumigatus: in vitro-assembled Cas9 guide RNA ribonucleoproteins coupled with microhomology repair templates. mSphere, 2 : e00446–17.
di Pietro F, Valon L, et al.. (2017) An RNAi screen in a novel model of oriented divisions identifies the actin-capping protein Z β as an essential regulator of spindle orientation. Curr Biol, 27 : 2452–2464.
除了以上的「扳手」和「螺紋釘」，針對(duì)整個(gè)編輯流程 IDT 還提供下列試劑為你的基因編輯保駕護(hù)航：
1. Alt-R? Genome Editing Detection Kit
可用于快速檢測(cè) CRISPR 的編輯效率；
2. Alt-R? CRISPR-Cas9 Electroporation Enhancer
可用于提高難轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的電轉(zhuǎn)效率。
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總結(jié)
以上是生活随笔為你收集整理的【评价】Integrated DNA Technologies公司基因编辑技术的全部?jī)?nèi)容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問(wèn)題。
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