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新生兒濕疹腸道菌群網絡結構圖譜

iMeta主頁：http://www.imeta.science

研究論文

●?原文鏈接DOI: https://doi.org/10.1002/imt2.90

●?2023年2月16日，南方醫科大學謝黎煒、馬穎團隊在iMeta在線發表了題為“Microbial network signatures of early colonizers in infants with eczema?”的文章。

●?本研究結合圖論與網絡算法系統探索了中國嬰兒生命早期的腸道菌群變化，聯合分析結果表明不同民族的健康嬰兒在生命初期的腸道菌群網絡形態發展規律相似；并且健康嬰兒的腸道菌群網絡形態比患有濕疹的嬰兒更穩定和復雜。此外，健康的嬰兒腸道菌群豐富度在生命早期逐步增高，而母親在孕晚期血清甘油三酯（TG）的高水平可能是出現新生兒濕疹的危險因素。

●?第一作者：黃柳菁、盤桂花

●?通訊作者：謝黎煒 (xielw@gdim.cn)、馬穎（mayingwuzhuoyi@126.com）

●?合作作者：馮譯菲、范紫晶、馬凱、王潤鑫、王廣賢、黃廣業、黃思霞、侯語匯、韓木蘭

●?主要單位：南方醫科大學珠江醫院婦產醫學中心；廣東省科學院微生物研究所，華南應用微生物國家重點實驗室；新鄉醫學院公共衛生學院；江蘇新申奧生物科技有限公司

亮? ?點

●?新生兒胎便菌群已具備一定的網絡拓撲學復雜度，隨著腸道菌群的成熟，菌群網絡復雜度呈增加趨勢

●?生命早期健康嬰兒的腸道菌群網絡結構比患有濕疹的嬰兒更復雜和更穩定

●?妊娠晚期甘油三脂水平升高可能是后代生命早期出現濕疹的危險因素

摘? ?要

既往研究表明腸道菌群與新生兒濕疹存在關聯關系，且患有濕疹的嬰兒腸道菌群出現失衡與紊亂。盡管嬰兒腸道菌群組成已相對明了，但菌群內部構成的網絡結構及其與宿主生理和病理表型的關系亟待研究。為了研究生命早期100天的腸道菌群網絡結構變化，我們在廣州開展了一項隊列研究，一共納入了34位足月陰道順產的嬰兒，并且采集了胎糞以及出生后3個月共計四個時間點的糞便樣本，并進行16S rRNA擴增子測序和數據分析。同時，我們額外納入了兩項隊列研究的健康嬰兒腸道菌群樣本來支持本研究的結果。本研究結合圖論與網絡算法系統探索了中國嬰兒生命早期的腸道菌群變化，此外，聯合分析結果表明不同民族的健康嬰兒在生命初期的腸道菌群網絡形態發展規律相似；并且健康嬰兒的腸道菌群網絡形態比患有濕疹的嬰兒更穩定和復雜。此外，健康的嬰兒腸道菌群豐富度在生命早期逐步增高，而母親在孕晚期血清甘油三酯（TG）的高水平可能是出現新生兒濕疹的危險因素。

視頻解讀

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全文解讀

引? 言

濕疹（也稱為特應性皮炎，AD）是一種免疫相關的炎癥性皮膚病，經常在生命早期發展并持續到成年期。根據全球疾病負擔調查，這種疾病影響了至少 15% 的兒童，并且其患病率逐年上升。該病的癥狀與年齡、疾病分期、種族和地理位置密切相關。在嬰兒中，濕疹通常會影響頭部、面部和四肢，導致皮膚干燥、開裂和鱗屑。

免疫印記可以追溯到胎兒時期，并與母體微生物群及其代謝物相關，例如短鏈脂肪酸 (SCFA)，已被證明在免疫調節中具有重要作用。微生物組成與人類健康密切相關，新生兒可通過接觸豐富的微生物并獲益。先鋒物種的初始定殖始于出生，隨后微生物多樣性和群落迅速增加。在生命的前 100 天，嬰兒主要從母乳或配方奶中獲取營養。一項大規模的薈萃分析發現，如果在出生后的前三個月進行純母乳喂養，具有AD家族史的兒童患AD的可能性較小。由于微生物多樣性與人類健康之間存在的密切關系，了解微生物群落的形成和維持對于靶向整個微生物群落的干預是十分重要的。

微生物群對宿主生理學影響的研究主要包括四個方面，即屏障功能、免疫調節、定植抵抗和發育。部分微生物可產生有益的代謝物并發揮功能，這些共生微生物的穩定性被認為是宿主健康和機體維持穩態的關鍵。因此，腸道微生物群的急劇變化往往與疾病的發生和發展密切相關。此外，在腸道生態系統中存在諸多細菌相互作用，通過在生態位內代謝物、能量、信號和其他物質的交換，各種微生物共同形成一個復雜的生態系統。為了剖析這個生態系統，網絡算法和圖論已經被用來揭示微生物群落內的競爭、共生和互動情況。

盡管臨床研究已經報道了腸道微生物群的改變與兒童濕疹患病率之間的關聯，使人們對兒童濕疹的微生物群失調有了深刻的了解，但仍然缺乏腸道菌群網絡結構在生命早期如何發生變化以及其與宿主表型關系的研究和探索。采集嬰兒期到幼兒期的糞便樣本進行縱向分析，可以動態的認識生命早期微生態的變化。尤其是生命早期100 天腸道菌群的組成和變化對免疫印記至關重要，而已發表的研究并未將此時間段作為研究重點。此外，母親孕前體重指數 (BMI) 對后代濕疹發展的影響仍存在爭議。因此，有必要使用網絡和圖論等方法深入探索腸道微生物組與濕疹風險之間的關系。

為了更好地了解嬰兒出生后前 100 天的腸道微生物網絡，我們在南方醫科大學珠江醫院婦產醫學中心招募，并采集了嬰兒出生以及出生后1、2 和 3 個月齡的糞便樣本，進行 16S 擴增子測序和數據分析，系統的探索了與濕疹相關的潛在微生物群因素。

結? 果

母嬰人口學特征及臨床檢查結果

在婦產醫學中心出生的新生兒，如果常規檢查無異常，則不進行任何血清學或影像學檢查。嬰兒性別、出生體重、身長 、頭圍、胎兒分娩方式和 Apgar 評分在對照組（Healthy Control）和病例組（Infantile eczema Group）之間的差異沒有統計學意義。兩組嬰兒都是純母乳喂養或主要母乳喂養，并且在采樣期間孕婦和胎兒沒有接受抗生素治療。入選的34位媽媽均居住在廣州，孕期均定期進行產檢。所有產婦入院后均接受了全面的體格檢查以備分娩，包括血常規檢查、凝血功能、肝腎功能、口服葡萄糖耐量試驗（OGTT）、感染性疾病、血型、甲狀腺功能和糖化血紅蛋白水平等。這些定期檢查的臨床指標，包括孕前體重指數（BMI）和孕期體重增加情況，在對照組和病例組之間沒有發現顯著差異。然而，病例組嬰兒的母親分娩前BMI明顯低于對照組（表1；表S1）。既往研究表明，孕前 BMI 和孕期體重增加均與圍產期并發癥和不良妊娠結局的發生有關。在本研究中，雖然母親孕前 BMI 在兩組間不存在顯著差異，但兩組嬰兒的母親在分娩前 BMI 存在顯著差異。此外，病例組嬰兒的母親在分娩前的血肌酐和甘油三酯 (TG) 水平顯著升高。兩組母親的肌酐均在正常范圍內（表 S1）。然而，因為懷孕期間激素的變化會導致甘油三酯的生理性升高，兩組母親的TG均高于正常范圍。但有研究提示，妊娠晚期母親血清中甘油三酯水平高可能與妊娠不良結局事件有關。

表1. 受試者嬰兒及母親的人口學特征及臨床檢查結果

健康嬰兒和濕疹嬰兒的腸道微生物多樣性不同

對照組和病例組門級微生物群的堆積條形圖如圖 1B 所示。嬰兒腸道中的主要先鋒菌在門水平包括變形菌門、厚壁菌門、放線菌門和擬桿菌門。其中，以藍色顯示的變形菌門和厚壁菌門在嬰兒胎糞樣本中為優勢菌，而變形菌和放線菌門在出生后第 1、2 和 3 個月的糞便樣本中占主要構成。Alpha 多樣性被用于描述腸道生態系統的微生物豐富度和均勻度。如圖 1C 所示，與胎糞相比，在嬰兒第 1、2 和 3 月齡糞便樣本中，對照組腸道菌群的Inverse Simpson (InvSimpson) 指數顯著升高。與對照組相比，病例組1、2和3月腸道菌群樣本的 InvSimpson 指數較胎糞樣本有增加趨勢，但未達到統計學差異（圖 1C）。基于主坐標分析（PCoA）的Beta多樣性結果表明，嬰兒第1、2和3個月的腸道微生物群結構與胎糞之間的差異具有統計學意義（圖 1D)。Beta多樣性結果與細菌相對豐度的堆疊條形圖中觀察到的結果相互呼應（圖 1B），在圖 1C中我們可以觀察到在第 1、2 和 3 個月收集的糞便樣本和胎便樣本之間的明顯差異。為了進一步驗證在不同時間點收集的樣本中微生物結構的組間變異性，對不同時間點樣本分別進行了降維分析。如結果所示，兩組嬰兒的胎糞樣本（圖 1E，p?= 0.1）、產后第 1 個月的糞便樣本（圖 1F，p?= 0.96）和產后第 2 個月（圖 1G，p?為 0.084）。在 PCoA 軸 2 的組間變異性逐漸變大，說明健康嬰兒和出現濕疹的嬰兒的腸道微生物群結構隨著發展和成熟過程中逐步出現差異。有趣的是，在產后第 3 個月觀察到 PCoA 軸 2 的差異具有統計學意義（圖 1H，p?= 0.011）。這些結果表明，腸道微生物群的組成在嬰兒期逐漸發生變化，對照組嬰兒的腸道菌群豐富度增加更為顯著。

圖 1. 生命早期嬰兒腸道菌群結構特點

（A）研究流程圖；（B）菌群堆積條形圖；（C）基于Inverse Simpson指數的Alpha多樣性箱線圖；（D）基于PCoA (Principal Coordinate Analysis)的β多樣性降維分析結果；（E）胎便樣本的β多樣性；（F）1月齡樣本的β多樣性；（G）2月齡樣本的β多樣性；（H）3月齡樣本的β多樣性。

健康嬰兒在生命早期微生物網絡具有相似的節律性

生態網絡的復雜性對生態系統穩定性具有重要作用，而我們對新生兒腸道微生物群網絡形態的了解不足。因此，我們利用受試嬰兒生命早期共計4個時間點的糞便樣本開展生命早期腸道微生物群網絡的結構研究。我們基于每組樣本的擴增子序列變異 (Amplicon sequence variant, ASV) 構建了時間序列分子生態網絡 (MEN)（圖 2A）。為了更好的說明腸道菌群在生命早期的網絡結構變化，我們整合了Roswall 等人的瑞典隊列和Christensen 等人的丹麥隊列中隨機選擇的 16 名健康嬰兒，獲得了在不同時間點收集的腸道菌群樣本，并構建 MEN（圖 S1A、B），我們可以觀察到生命早期腸道微生物群中存在的交互網絡。網絡拓撲學指標用于展示視覺映射，包括簇數（Number of clusters, No. Clusters）、邊數（Number of edges, Num. Edges）、正相關邊數（Number of positive edges, Num. Pos. Edges）、負相關邊數（Number of negative edges, Num. Neg. Edges）、直徑（Diameter）、平均路徑（Average path length）, 中介中心性（Centralization betweenness），其中幾個網絡圖論指數在胎便樣本中大于零，表明健康新生兒腸道中已經存在一定程度的微生物群網絡（圖2B）。

圖2. 生命早期腸道菌群網絡結構變化

（A）時間序列分子生態網絡 (MEN)；（B）網絡拓撲學指標，折線圖分別反映了本研究中的健康嬰兒（綠色）和患有濕疹的嬰兒（藍色），以及兩個獨立研究的健康嬰兒（綠色）腸道網絡結構變化。

降低生產成本并保護環境

從結果中，我們可以觀察到健康嬰兒早期先鋒菌網絡拓撲結構的復雜性已具備一定水平，例如簇數、邊數、正相關邊數、頂點數、平均度（Average degree, Average K）、相對模塊化（Relative modularity, RM）、集中度（Centralization degree）（圖 2B；圖 S1C）。從綠色的折線圖中，我們可以觀察到這些指標從第二個采樣時間點開始逐漸增加，提示網絡隨著時間的推移變得復雜和成熟。在 Roswall 等人和 Christensen 等人的研究提取的獨立隊列數據分析結果中，這些網絡拓撲學指標仍然為零，例如直徑、平均路徑和中介中心性；但是當前隊列中健康嬰兒的結果可以觀察到一定變化趨勢。我們推測這是由于 16S rRNA 數據的測序質量差異所致。在我們的研究中，由于采用了標準嚴格的采樣流程、測序流程以及主流測序儀，我們獲得了高質量的測序數據。相反，對獨立隊列的16S rRNA數據進行質量控制過程中過濾了不合格的序列，導致下游分析的ASV數量有限。為了進一步探索獨立隊列的基本微生物特征，我們分別繪制了菌群堆積條形圖并且進行了alpha 多樣性和 beta 多樣性分析（圖 S2）。從圖中我們可以得出結論，雖然健康嬰兒的腸道微生物特征在三個數據集中有所不同，但網絡拓撲指數在新生兒胎便樣本中處于較高水平，并且網絡復雜性隨著腸道微生物群的成熟而逐漸增加。值得注意的是，三批時序數據的keystone節點數指標均為零，反映出雖然生命早期腸道內已經形成了稀疏的網絡結構，但目前還沒有滿足算法界定的核心先鋒菌。此外，在本研究嬰兒3月齡采集的腸道菌群中觀察到負相關邊數的出現，反映了先鋒菌之間的競爭。總之，這些數據表明網絡拓撲指數在胎便樣本中較高，并且隨著腸道菌群的成熟可以觀察到網絡復雜性增加的趨勢。上述結果表明，健康嬰兒的腸道微生物網絡存在節律性變化，這可能對生命早期的健康發展至關重要。

健康嬰兒的腸道微生物群網絡更密集

人體腸道微生物群存在內部相互作用并且微生物群的網絡穩定性對宿主健康至關重要，但目前對網絡穩態仍知之甚少。嬰兒時期的腸道微生物群一直是人們關注的焦點，這是腸道微生物群和其他生理和生物學過程發展的一個重要時期。因此，探索生命早期100天的微生物群的互作并識別其變化規律有利于加深我們對新生兒濕疹的認識。在本研究中，相同時間點對照組嬰兒腸道菌群的簇數高于病例組嬰兒（圖 2B）。另外，對照組嬰兒腸道菌群簇數自出生起開始增加，第3個月略有減少，但仍高于第1個月和胎便樣本。而病例組嬰兒腸道菌群簇數在出生后減少，然后在第3個月顯著增加。對照組健康嬰兒腸道菌群網絡圖中邊數、正相關邊數和頂點的數量先減少后增加，這個動態模式也在兩個獨立數據集中得到驗證。而在病例組中邊數和正相關邊數在第三個月明顯下降，而頂點數則在生命早期趨于平穩。由于在獨立數據集中獲得的頂點數量較少，MEN直徑在這種映射模式下沒有改變。另一個有趣的結果是，對照組嬰兒3月齡時，腸道菌群可觀察到負相關的邊，反映了微生物群落中競爭拮抗簇的出現，但在病例組中沒有觀察到該現象。不僅如此，代表病例組的藍色折線在多個網絡拓撲指數中的變化均出現異常。例如，邊數、正相關邊數、連接性（Connectance , Edge density）、平均度、接近中心性（Centralization closeness）、中心度（Centralization degree）均在第二個月出現高峰，并在第三個月驟降，這種驟變可能與嬰兒濕疹的發病有關（圖 2B；圖 S1C）。總的來說，我們發現濕疹嬰兒的網絡特征節律缺失，而健康嬰兒的腸道微生物群網絡更加密集。

嬰兒腸道菌群的建立

菌株水平研究發現，母嬰之間菌株的垂直傳播是嬰兒腸道先鋒菌的主要來源。鑒于 16S 擴增子測序在物種水平鑒定準確性的不足，本研究中，我們分析比較了不同時間點兩組樣本間菌科的差異，但沒有觀察到任何具有統計學意義的差異菌。該結果可能是由于本項研究招募的嬰兒均為陰道分娩，并且在出生后的前 3 個月內采取純母乳喂養或者母乳喂養為主僅偶爾補充配方奶粉。三元圖被用于展示嬰兒腸道中先鋒菌的發展轉化過程（圖 3A、B）。在對照組和病例組的胎便、產后1月和產后3月腸道菌群樣本中，腸桿菌科和雙歧桿菌科都是生命早期的優勢細菌（表 S2 和 S3）。從三元圖中灰色線條內部區域可見到對照組和病例組分別只有 2 個和 5 個優勢菌科從出生持續到第 3 個月，反映了生命早期腸道微生物群的劇烈變化（圖 3A、B）。乳桿菌科在胎便樣本中占比更高（圖 3A，B），開始接受哺乳后采集的腸道菌群中乳桿菌科的占比不及 1%（圖 3C）。腸桿菌科是一類兼性厭氧菌，是人類和動物的共生菌之一。另一方面，雙歧桿菌科和乳桿菌科在生命早期展現出相反的變化趨勢。長雙歧桿菌、動物雙歧桿菌和鼠李糖乳桿菌等均是在這兩個益生菌科下的有益菌，在既往大量研究中被報導能夠改善機體健康。在本研究中，我們觀察到嬰兒糞便中乳桿菌科的相對豐度在母乳喂養開始后顯著下降（圖 3C）。相比之下，雙歧桿菌科在哺乳開始后在腸道中更為豐富（圖 3D）。從三元圖中，我們還可以得出結論，健康嬰兒和患有濕疹的嬰兒腸道菌群的發育模式存在很大差異。

圖3. 嬰兒腸道菌群的建立

（A）健康嬰兒胎便、出生1月和2月腸道菌群三元圖；（B）患有濕疹的嬰兒胎便、出生1月和2月腸道菌群三元圖；（C）乳桿菌科相對豐度箱線圖；（D）雙歧桿菌科相對豐度箱線圖。

母親妊娠晚期甘油三酯水平升高可能是濕疹的危險因素

根據變量特征采用獨立t檢驗、Mann-Whitney檢驗、卡方檢驗和Fisher精確檢驗對兩組嬰兒基本特征、母體人口統計學和臨床檢查結果進行單變量比較。為了確定與濕疹存在獨立相關的變量，選擇單變量分析中 p?< 0.05 的變量作為多元邏輯回歸的潛在自變量。產婦孕前BMI統計結果雖然未達到0.05的統計閾值，但對產前BMI有直接影響。因此，將孕前BMI一并納入到多元邏輯回歸分析。統計結果如表2所示，濕疹的發生與母親孕晚期 TG 水平呈正相關（校正后的比值比 = 3.41 (95% CI: 1.13-10.25)，p?= 0.029)。因此，母親妊娠晚期甘油三酯水平高可能是濕疹的危險因素。

表2. 多元邏輯回歸

討? 論

我們以間隔一月的采樣頻率收集了嬰兒出生后4個時間點的糞便樣本，并完成了定期隨訪以獲取每對母嬰的詳細信息。聯合另外兩項獨立縱向調查的 16S rRNA擴增子測序數據，我們發現新生兒胎便菌群已具備一定的網絡拓撲學復雜度，隨著腸道菌群的發育，菌群網絡復雜度呈增加趨勢。此外，基于我們采集的數據發現健康嬰兒的腸道微生物群網絡比患有濕疹的嬰兒更密集。我們的研究結果還表明，腸道微生物群的生態演替在嬰兒期是一個動態過程，健康的嬰兒在生命早期100天的腸道微生物豐富度增加明顯，母親妊娠晚期血清中甘油三酯水平升高可能是新生兒濕疹的危險因素。

越來越多的證據表明，腸道微生物群對于免疫系統的發育以及新生兒、嬰兒、兒童和成人時期濕疹的預防至關重要。其中，一些橫斷面研究獲得了 6 個月以下嬰兒的糞便樣本，而其他研究則進行了縱向研究。一項縱向研究通過對 5 周齡至 6-11 歲兒童糞便微生物群進行連續采樣，數據表明微生物多樣性和組成的改變要早于過敏的出現。此外，腸道菌群自出生時建立，隨后微生物多樣性和群落迅速增加。這些研究強調了生命早期微生物演替和成熟的重要性，但是研究中納入出生后 100 天嬰兒糞便的設計并不多。只有一項研究覆蓋了來自產后 5、13、21 和 31 周以及6 至 11 歲兒童（嬰兒）的樣本；然而，該研究采樣間隔大，而且沒有采集胎便樣本。在我們的研究中，以一個月的采樣間隔，在四個時間點收集嬰兒糞便樣本，使我們能夠探索生命早期的微生物特征和成熟。此外，最近發表的一項研究表明，沒有證據表明胎便菌群組成與 4 歲以下兒童的特應性皮炎有關。在本研究中，胎便菌群結構在組間未觀察到明顯差異，但從第 2 個月的腸道菌群中可以觀察到差異（圖 1G，p = 0.084），并在第 3 個月達到統計顯著性（圖 1H，p = 0.011)。總的來說，在控制了包括出生方式、母乳喂養狀態和抗生素使用情況這些混雜因素后，我們發現患有濕疹的嬰兒在出生后的頭 100 天內的 alpha 和 beta 多樣性發展情況與健康嬰兒相比存在異常。

在漫長的歷史中，圖論作為數學的一個分支，以圖為研究對象進行節點和邊關系的數學推理。隨著社交網絡分析和網絡科學的發展，網絡研究得到越來越多的關注，圖論也開始應用于這些領域。然而，新生兒微生物組研究大多缺乏對菌群網絡特性的進一步描述。共現網絡是最常用的網絡類型之一，它可以直觀地顯示不同微生物類群之間的正相關和負相關關系。雖然共現網絡可以顯示不同分微生物類群之間的復雜關系，但我們不能忽視一個事實，即不存在一個完全適用的健康微生物組配置。ASV 是微生物的預注釋核酸序列，可以更好地應用于構建網絡結構以證明生態系統內的相互聯系。此外，在基于人群的宏基因組學分析中，作者證明 16S rRNA 基因測序在預測微生物科級別結果要多于宏基因組鳥槍法測序。結合網絡拓撲指標與ASV結果能共同體現網絡的復雜性和穩定性。為了驗證我們的假設，即生命早期腸道微生物網絡節律的動態變化與嬰兒的健康密切相關，我們基于三個獨立數據集的科水平的 ASV 構建了 MEN，并證明了不同國家的健康嬰兒的網絡拓撲指標共享一致的動態變化；并說明了與患有濕疹的嬰兒相比，健康嬰兒具有更密集的腸道微生物群網絡。

濕疹的原因是多方面的，包括遺傳、父母和生活環境等。在這些因素中，嬰兒的腸道微生物組對兒童免疫系統的發育具有重要影響。在本研究中，InvSimpson 指數在生命早期的健康嬰兒中顯著升高，而患有濕疹的嬰兒只能觀察到升高的趨勢但變化沒有統計學意義（圖 1C）。結果表明 InvSimpson 指數可能是一種保護因素，這與之前的研究一致。InvSimpson 指數是能夠反映微生物組豐富度和均勻度的 alpha 多樣性指數之一。其中一個可能的原因是兩組嬰兒的生活環境不同。較早的一項研究發現，父親受過高等教育的嬰兒患濕疹的風險更高（OR_adj（95% CI）= 9.93（1.83-53.71），p?= 0.008）。研究人員還推測，受教育程度較高的父親可能對衛生保潔有更高的要求，這表明嬰兒在早期因接觸不衛生環境而感染傳播性疾病的概率較低，但這可能是過敏性疾病的患病率上升的原因。另一項研究調查了城市化微生物群對嬰兒、免疫體質和特應性疾病發病的影響，表明城市化引起的嬰兒微生物群的變化可能會通過影響免疫系統的發育而增加患哮喘和特應性皮炎的風險。另一方面，越來越多的研究調查了農村生活對嬰兒成長的有益影響，強調由于城市化發展，嬰兒不能暴露于某些微生物的環境導致了過敏性疾病的全球上升。盡管在本研究中的嬰兒均在中國，廣州，這個城市化程度高的城市出生和長大，但他們的生活環境可能仍然不同。上述研究發現可以通過接觸非城市化環境來提高腸道微生物多樣性，這可能是降低過敏性疾病風險的一種方法。在目前的研究中，從α多樣性和網絡特性的指標，我們可以觀察到濕疹嬰兒腸道菌群的發育出現了異常。我們推測腸道中早期定植菌的豐富性對于發展復雜的微生物網絡可能很重要。據報道，益生菌、益生元和合生元在預防和治療許多健康問題都表現出一定的潛力，我們推測對于腸道微生態失調的濕疹嬰兒適當的補充微生態制劑有望通過增加腸道菌群的豐富度來促進微生物網絡的進展。除了可能與環境因素密切相關的InvSimpson指數外，目前的研究發現，母親孕晚期血清甘油三酯升高可能是濕疹的危險因素（OR_adj（95% CI）=3.41（1.13-10.25） , p = 0.029)。雖然兩組母親產前BMI存在顯著差異，但多元邏輯回歸分析表明，只有孕晚期產婦TG高是濕疹發生的危險因素。既往研究中，有研究發現母親肥胖和妊娠期體重增加不是特應性疾病的危險因素，同時也有報道稱母親孕前BMI是兒童期濕疹的危險因素之一。其中的機制仍需要進一步研究闡明。

這項研究存在一定的局限性。首先，它不是基于大樣本的研究，往后應該進一步擴大隊列。季節變化和不同的氣候因素對濕疹的發病和嚴重程度存在一定影響。雖然本研究的嬰兒是在中國廣州的夏季招募的，當時氣溫在 30 攝氏度左右，但我們沒有對嬰兒的成長環境進行調查。此外，濕疹被認為與整個嬰幼兒時期的睡眠質量受損有關，這強調了長期跟蹤受試嬰兒的疾病嚴重程度、同期出現的癥狀以及睡眠質量和睡眠持續時間的重要性。最后，如果能夠持續每日采樣將能夠更細致地發現腸道微生物初期演替過程中網絡復雜性發展的規律。

結? 論

網絡分析和圖論可用于發現微生物群的形成和構建過程。在本研究中，不同種族的健康嬰兒在生命早期具有相似的腸道微生物網絡變化，而與健康嬰兒相比，患有濕疹的嬰兒則表現出更稀疏和波動的網絡。通過時間序列數據，我們證明濕疹嬰兒的微生物結構在第 3 個月出現明顯失調。研究結果還提示母親妊娠晚期血清甘油三酯水平升高可能與嬰兒濕疹的發生有關。

方? 法

受試者入組

2021年6月至2021年10月，對中國廣州市南方醫科大學珠江醫院產科收治的所有孕婦進行了健康評估。先前的研究表明，嬰兒出生方式會顯著影響腸道菌群的結構，在陰道分娩過程中嬰兒通過垂直傳播途徑接觸到母親陰道中的乳桿菌。因此，我們僅招募了陰道分娩的嬰兒。此外，世界衛生組織 (WHO) 和聯合國國際兒童緊急基金會 (UNICEF) 建議兒童在出生后的第一個小時內開始母乳喂養，并在出生后的前 6 個月內進行純母乳喂養。因此，本研究僅納入了具有純母乳喂養意愿的孕婦。由于個體間存在微生物群的異質性，我們在入組期間設計了嚴格的標準（如入組排除條件所示），盡管在本市的三甲醫院展開研究，4 個月內共入組的隊列規模仍然較小。在當前的研究中，我們對 876 名健康孕婦及其嬰兒進行了初篩，其中大部分因不符合入組標準或拒絕參加本研究而未被納入。進入采樣流程的母嬰共計42對。生命中的早期定殖者對健康至關重要，尤其是對嬰兒免疫系統的發育。(新生兒)胎便主要在胎兒時期形成，而胎兒處于相對厭氧的環境中，胎糞樣本中兼性厭氧菌和嚴格厭氧菌的比例明顯高于后期采集的嬰兒糞便。由于免疫系統的發育可以追溯到胚胎期，我們推測胎便的網絡結構可能與免疫系統的發生有關。

因此，分娩后嬰兒的胎便樣本由醫生在醫院采集。我們給所有的母親發放了居家采樣指南，介紹了在家中收集產后第 1、2、3 個月嬰兒糞便樣本的正確方法。我們在產后前3個月提供健康指導并記錄母嬰的基本信息，例如健康狀況和藥物使用情況。在嬰兒 6 月齡時再次通過問卷收集嬰兒的健康狀況信息。然而，在采樣期間，有 7 對母嬰因拒絕繼續配合或診斷出疾病而退出研究。所以最終，我們從 35 對母嬰處獲得了4個時間點的樣本，并對這些樣本進行了 16S rRNA 基因擴增子測序。由于一位母親在產后 6 個月回訪時沒有完成問卷調查，我們對其余 34 名嬰兒根據 6 個月內是否出現濕疹進行分組，得到從未發生濕疹的 22 名健康嬰兒（對照組）和 12 名濕疹嬰兒（病例組）。

納入、排除標準

出生方式、母體抗生素使用和母乳喂養是影響早期微生物群發展的首要影響因素，因此我們設計了嚴格的納入和排除標準以盡量減少偏倚。本研究的納入標準為：1）年齡在20-40歲之間的健康孕婦；2) 陰道分娩的嬰兒；3) 孕婦孕前BMI < 28；4）孕婦具有純母乳喂養的意愿；5）嬰兒出生體重在2500-4000克之間。排除標準包括：1）妊娠期糖尿病、抑郁癥、高血壓等疾病；2) 分娩前3個月內服用過益生菌或抗生素；3) 分娩時使用抗生素；4) 孕期吸煙、飲酒史；5）分娩前3個月內腹瀉；6）產后100天內使用抗生素；7) 在采樣期間拒絕純母乳喂養或主要母乳喂養；8) 診斷遺傳性疾病。

最后，35 對母嬰完成了4個時間點的縱向取樣和同期的回訪。一對母嬰在第 6 個月時因未填寫問卷而排除出組，最后獲得34對母嬰完整的配對樣本及數據。在實驗開始之前，所有參與者都已被告知實驗存在的風險和參與者的權益，并且我們已獲得每位受試者嬰兒監護人簽署的知情同意書。

倫理

所有與研究相關的方案均經南方醫科大學珠江醫院醫學倫理委員會批準，并在 clinicalTrials.gov 注冊，編號為NCT05462366。

臨床研究人群和元數據

目前的隊列包括 34 位陰道分娩的足月嬰兒。沒有使用統計方法來預先確定樣本量，但是根據以往研究的樣本量評估，我們假設 34 個嬰兒的四個時間點樣本足以說明微生物網絡的動態變化情況。所有入組嬰兒均在珠江醫院婦產醫學中心出生，出生后醫生評估無任何疾病癥狀，并在最初24小時內進行母乳喂養。經過培訓的醫生負責收集胎便樣本于無菌管中，并教導嬰兒的父母在產后第 1、2 和 3 個月從潔凈尿布中收集糞便樣本到無菌管中的方法，并于每次采樣前進行再次解說。收集樣品后，將試管連同厭氧袋 (MGC AnaeroPack-Anaero) 一起保存在密封培養袋 (MGC AnaeroPack-Anaero) 中。培養袋和冰袋一同放入保溫箱內，立即送至廣東省科學院微生物國家重點實驗室進行益生菌分離（如乳酸桿菌和雙歧桿菌），其余樣品液氮冷凍后-80℃保存直至制樣。通過產后第 1、2、3 個月的回訪和產后 第 6 個月的問卷調查收集母嬰的健康狀況、喂養方式、用藥和一般信息。雖然嬰兒大多是母乳喂養為主，但也有一些嬰兒因某些原因偶爾會補充配方奶粉，包括母乳不足、進餐時間母親不在嬰兒身邊、補充營養等。根據醫生問診的情況和問卷調查結果，我們將出生 6 個月內從未發生過濕疹的嬰兒作為對照組，其余嬰兒作為病例組。在所有參與者中，只有一名對照組的嬰兒有濕疹家族史。

Roswall 等人的驗證數據由來自原始隊列隨機選取的 16 名健康瑞典嬰兒組成。在出生、第 4 個月、第 1 年和第 3 年收集的配對糞便樣本16S rRNA擴增子測序數據用于網絡分析。Christensen 等人的驗證數據由來自原始隊列隨機選取的 16 名健康丹麥嬰兒組成。在出生、1 個月和 1 歲時收集的配對糞便樣本16S rRNA擴增子測序數據用于網絡分析。

腸道菌群分析

按照制造商的說明進行樣品制備，使用 E.Z.N.A.? Stool DNA 試劑盒（D4015，Omega, Inc., USA）從樣品中提取 DNA。使用 341F (5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3') 和 805R (5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3')引物，擴增了細菌和古細菌 16S rRNA 基因的 V3-V4 區域。16S rRNA 擴增子測序和生物信息學分析：根據 LC-Bio 的使用說明，使用 Illumina NovaSeq 平臺對樣品進行測序。使用 FLASH 合并雙端測序序列。基于 QIIME2（2022-2版）使用 dada2 去噪（生成 ASV 表）、特征數據匯總、分類學分析（比對數據庫為 Greengenes 13_8）和生成分類表。通過刪除低豐度分類群（平均相對豐度 < 0.1%；亞組內出現率 < 10%）來過濾分類表。過濾后的分類表用于微生物分析。網絡分析是基于 R 包 ggClusterNet（版本 0.1.0）進行的， MEN繪圖基于model_igraph (method="cluster_fast_greedy") 函數模塊。Alpha多樣性、Beta多樣性、主坐標分析（PCoA）、置換多元方差分析（PERMANOVA）是用自主開發的微生物分析 R 包 EasyMicroPlot（版本 0.5.1）進行的。

統計分析

所有數據分析均在 R 版本 4.2.1 中進行。為了探索網絡拓撲學指數變化，我們使用 R 包 ggClusterNet（版本 0.1.0）基于 Spearman 相關性分析和 Benjamini-Hochberg 方法來調整 p 值。在網絡分析中，所有分子網絡都是基于 ASV 相對豐度的 Spearman 相關性構建的，Benjamini-Hochberg 調整的 p 值閾值為 0.05，相關系數的絕對值應大于 0.3。在統計分析之前，進行了Shapiro-Wilk 檢驗以驗證測量的正態性。根據變量的分布，Mann-Whitney 檢驗或非配對的 Student's t檢驗用于計量資料統計。Kruskal-Wallis 平均值檢驗用于評估組間的非參數比較。使用單因素方差分析 (ANOVA) 檢驗多組之間差異的顯著性，然后進行最小顯著差數法 (Least Significant Difference, LSD) 進行多重比較。具有不同字母的組表示差異具有統計學意義，而具有相同字符的組表示在 LSD 檢驗中 p?> 0.05。

貢獻者

謝黎煒研究員和馬穎教授設計了這項研究并獲得了資助。馬凱、王潤鑫和王廣賢代表江蘇新申奧生物科技有限公司的成員，該公司提供橫向經費支持該研究的開展。黃柳菁、盤桂花、馮譯菲、范紫晶、黃廣業、黃思霞、侯語匯和韓木蘭參與樣本的收集和測序數據的分析。黃柳菁和謝黎煒起草并編輯了文章，核對并驗證了文章中報告的數據。

數據共享聲明

所有 16S rRNA 基因擴增子測序數據均保存在國家微生物數據中心 (NMDC, https://nmdc.cn/) BioProjects NMDC10018172 下。來自 Roswall 等人和 Christensen 等人研究的驗證 16S rRNA 基因擴增子測序數據分別列于補充表 4 和補充表 5 中。用于數據處理、分析和可視化的代碼腳本已存放在 GitHub (https://github.com/xielab2017/EasyMicroPlot)。根據要求，可從相應的作者處獲得更多信息。

致謝

我們非常感謝珠江醫院婦產科的工作人員在志愿者入組及回訪過程中提供的幫助與支持。感謝Xie Lab實驗室的成員在樣本采集和后續研究中提供的出色協助。以及為本研究提供資助的江蘇新申奧生物科技有限公司和中國國家自然基金以及廣東省基礎與應用基礎杰出青年基金的支持。

引文格式：

Huang, Liujing, Guihua Pan, Yifei Feng, Zijing Fan, Kai Ma, Runxin Wang, Guangxian Wang, Guangye Huang, Sixia Huang, Yuhui Hou, Mulan Han, Liwei Xie, and Ying Ma 2023. “Microbial network signatures of early colonizers in infants with eczema.” iMeta. e90. https://doi.org/10.1002/imt2.90

作者簡介

黃柳菁（第一作者）

●??南方醫科大學醫學碩士

●??目前研究方向為婦產醫學與微生物組數據分析與挖掘

盤桂花（第一作者）

●??廣州中醫藥大學醫學碩士

●??研究方向為腸道菌群與炎癥性腸病

謝黎煒（通訊作者）

●??廣東省科學院微生物研究所研究員，華南應用微生物國家重點實驗室主任助理，腸道微生態與健康研究團隊PI，南方醫科大學珠江醫院內分泌代謝科特聘教授，博士生導師，廣東醫科大學博士生導師，新鄉醫學院公共衛生學院特聘教授，碩士生導師，廣東省基礎與應用基礎杰出青年基金獲得者

●??2013 年獲得美國佛羅里達大學營養學博士，2013-2017年分別在美國密歇根大學醫學院和喬治亞大學分子醫藥中心從事博士后研究，2017 年獲得廣東省科學院和廣東省科學院微生物研究所海外高層次人才引進資助，依托華南應用微生物國家重點實驗室組建腸道微生態與健康團隊，主要研究方向腸道菌群與健康和疾病，內容涉及系統微量元素代謝、肌肉干細胞和脂肪脂肪的生理調控機制以及腸道菌群與宿主營養代謝相互調節機理在代謝性疾病中的作用機制和轉化應用，近 5年，共發表高水平研究性論文 40 余篇，他引超過 1000 次，單篇最高超過 100 次；研究成果主要發表在 Advanced Science（IF：17.608）、Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle（IF：12.90）、Journal of Clinical Investigation（IF：17.884）和 FASEB J（IF：5.486）等國際知名期刊。獲得國家自然基金面上（2 項）和青年項目（1 項），廣東省基礎與應用基礎杰出青年基金等科研支持。申請發明專利 8 件，獲批 3 件

馬穎（通訊作者）

●??南方醫科大學珠江醫院婦科副主任、主任醫師、副教授、醫學博士、博士研究生導師，美國約翰斯霍普金斯大學醫學院博士后、廣東省杰出青年醫學人才（第一批）、嶺南名醫、羊城好醫生、廣東最強科室之實力中青年醫師、首屆珠江青年醫師獎獲得者

●??主持國家自然科學基金1項、國家教育部課題2項、省部級課題8項、橫向課題1項、臨床研究2項。以第一作者及通訊作者發表SCI及核心期刊論文60余篇，參編專著2部

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第1卷第1期

第1卷第2期

第1卷第3期

第1卷第4期

期刊簡介

“iMeta” 是由威立、腸菌分會和本領域數百位華人科學家合作出版的開放獲取期刊，主編由中科院微生物所劉雙江研究員和荷蘭格羅寧根大學傅靜遠教授擔任。目的是發表原創研究、方法和綜述以促進宏基因組學、微生物組和生物信息學發展。目標是發表前10%(IF > 15)的高影響力論文。期刊特色包括視頻投稿、可重復分析、圖片打磨、青年編委、前3年免出版費、50萬用戶的社交媒體宣傳等。2022年2月正式創刊發行！

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