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背景介紹(Introduction)

宏基因組學(xué)

宏基因組學(xué)目前的主要研究方法包括：16S/ITS/18S擴(kuò)增子、宏基因組、宏轉(zhuǎn)錄組和代謝組，其中以擴(kuò)增子研究最為廣泛。

目的意義

本系列文章將帶領(lǐng)大家結(jié)合較新的16S/ITS擴(kuò)增子相關(guān)文獻(xiàn)，來(lái)理解宏基因組擴(kuò)增子文章中常用圖表種類、圖中包括的基本信息，以及作者想表達(dá)的結(jié)果。

主要內(nèi)容

本系列文章內(nèi)容包括：箱線圖、折線圖、柱狀圖、散點(diǎn)圖、火山圖、熱圖、曼哈頓圖、維恩圖、三元圖和網(wǎng)絡(luò)圖等。

學(xué)習(xí)思路

羅列知識(shí)點(diǎn)，熟悉專業(yè)名詞，弄個(gè)臉熟，即使理解不深刻起碼在閱讀中不會(huì)有抵觸情緒；

結(jié)合具體文章讀圖，實(shí)戰(zhàn)兩三次，基本就是專業(yè)人士了。

將來(lái)在大家可以很好理解相關(guān)文章圖表的基礎(chǔ)上，希望對(duì)分析、統(tǒng)計(jì)和繪圖相關(guān)技術(shù)有進(jìn)一步學(xué)習(xí)的小伙伴請(qǐng)積極回復(fù)并留言吧。如果本系統(tǒng)文章閱讀過(guò)萬(wàn)，想學(xué)分析的留言過(guò)百。我還將詳細(xì)講解擴(kuò)增子分析、統(tǒng)計(jì)和繪圖各步驟的分析實(shí)例和源代碼，希望大家多多鼓勵(lì)和支持。

聲明：文章的解讀僅代表個(gè)人理解和觀點(diǎn)，有不足處，請(qǐng)讀者積極留言批評(píng)指正，互相學(xué)習(xí)，共同進(jìn)步。

知識(shí)點(diǎn)(Method)

三元圖/三元相圖 Ternary Plot

三元圖有6種英文叫法，其中ternary plot最為常用。三元圖是重心圖的一種，它有三個(gè)變量，但需要三者總和為恒定值。在一個(gè)等邊三角形坐標(biāo)系中，圖中某一點(diǎn)的位置代表三個(gè)變量間的比例關(guān)系。常用于物理化學(xué)、 巖石學(xué)、礦物學(xué)、冶金學(xué)和其它物理科學(xué)，用于表示在同一個(gè)系統(tǒng)中三組分間的比例。在群體遺傳學(xué)中，它被稱做Finetti圖；在博弈論中，常被稱為simplex圖。
A ternary plot, ternary graph, triangle plot, simplex plot, Gibbs triangle or de Finetti diagram is a barycentric plot on three variables which sum to a constant. It graphically depicts the ratios of the three variables as positions in an equilateral triangle. It is used in physical chemistry, petrology, mineralogy, metallurgy, and other physical sciences to show the compositions of systems composed of three species. In population genetics, it is often called a de Finetti diagram. In game theory, it is often called a simplex plot.
在高通量測(cè)序分析領(lǐng)域中，最常用的是兩組間的比較，展示的方式有火山圖、曼哈頓圖等，而三組互相兩兩比較需要展示三個(gè)圖嗎？就沒(méi)有更好的展示方式了嗎？三元圖的引入解決了這一問(wèn)題。近年來(lái)，常用于展示三組間的相對(duì)基因表達(dá)或OTU豐度，即美觀，又有意義。

三元圖的傳統(tǒng)應(yīng)用

上圖示例是化學(xué)領(lǐng)域中傳統(tǒng)應(yīng)用，展示在空氣中(氧21%，氮79%)中混入甲烷(可燃?xì)怏w)時(shí)可燃的范圍。圖中藍(lán)色線上的任意點(diǎn)，代表其中氧和氮始終保持21：79的比例關(guān)系，正是空氣的基本性質(zhì)，即使有甲烷混入氧氮的比例始終恒定；深黃色區(qū)域?yàn)榧淄樵诖藚^(qū)域范圍內(nèi)的含量條件下才可燃；而藍(lán)線與深黃區(qū)域重合部分，表示只有在空氣中混入這一濃度范圍內(nèi)的甲烷才是可燃的。
這部分是科普下背景，看不懂沒(méi)關(guān)系，本文下面重點(diǎn)細(xì)講在生物學(xué)擴(kuò)增子分析中的應(yīng)用。

三元圖點(diǎn)位置的讀法

快速看誰(shuí)多誰(shuí)少

快速理解位置意義：重心圖，你看目標(biāo)點(diǎn)離那個(gè)角近，就是它在相應(yīng)的組中相對(duì)比例高；反之離某個(gè)角遠(yuǎn)，其相對(duì)比例也低。

精確讀三組比例

1. 雙平行線/小等邊三角形法：由點(diǎn)向底邊做兩條平行線建立小正三角形，將底邊分成三段，中間為頂部組所占比例，左段為右側(cè)組比例，右段為左側(cè)組比例。

垂線法：點(diǎn)向三條邊做垂線，穿越的格數(shù)，即對(duì)角組中所占比例；

向各邊零坐標(biāo)方向作平行線法：按坐標(biāo)系組的顏色和數(shù)值直接讀各組比例；(圖中所示方法，A和B均略大于0.3，而C接近0.4)

三元圖規(guī)律

三角形邊平等線上的點(diǎn)，在平行線對(duì)應(yīng)的頂點(diǎn)組所占比例是恒定的。

頂點(diǎn)到底邊直線上的點(diǎn)，上面任意點(diǎn)中兩底角組相對(duì)比例恒定。

三元圖點(diǎn)大小的意義

通常代表基因/OTU的相對(duì)表達(dá)/豐度，而且為了防止點(diǎn)過(guò)大或過(guò)小，數(shù)據(jù)通常還需要經(jīng)過(guò)log2變換，將表達(dá)范圍從0-1百萬(wàn)，轉(zhuǎn)換為0-20的區(qū)間；如果是OTU的千分比，則轉(zhuǎn)換為0-10的區(qū)間。

三元圖優(yōu)點(diǎn)

打破了普通兩兩比較火山圖展示方式，可將三組兩兩比較和三組的相對(duì)關(guān)系展示在同張圖中；

兩組只能比較一次，三組可以比較三次，可説的結(jié)果非常多；

三是個(gè)非常好的數(shù)字，2組比較太常見(jiàn)且單調(diào)，4組及以上信息量大讓人暈，三組正好高端大氣上檔次，而且還有內(nèi)涵。

三元圖繪制工具

我用過(guò)Sigmaplot可以輕松繪制，引文有origin的繪制教程。其實(shí)喜歡用R語(yǔ)言的朋友，有很多包可以選擇，如grid、ggplot2、ggtern，其中以ggtern最為簡(jiǎn)便。

看圖實(shí)戰(zhàn)(Result)

示例1. 三元圖展示底角兩組共有和特有顯著富集OTU

Bulgarelli, D., et al. (2015). Cell Host Microbe 17(3): 392-403. Fig. 3?
這篇文章分析大麥不同生態(tài)位和不同品種間細(xì)菌組間的差異。文中正文使用了3個(gè)三元圖。

圖3.A 展示大麥根部土壤、根際和根三種分態(tài)位間差異的OTU，并結(jié)合餅形圖展示這些顯著差異OTU的分類學(xué)門/綱水平信息。

圖中元素解釋

• 圖中三個(gè)頂點(diǎn)上、右、左，分別代表三個(gè)實(shí)驗(yàn)組，分別是土壤(Soil)、根際(Rhizosphere)、根(Root)

• 圖中的點(diǎn)代表每個(gè)OTU，作者只篩選了相對(duì)豐度高于0.5%的數(shù)百個(gè)OTU在圖中展示(此圖點(diǎn)超過(guò)300點(diǎn)重疊起來(lái)實(shí)在看不清)；

• 點(diǎn)的大小代表OTU的相對(duì)豐度，是三組所有樣品的平均豐度，通常是千分比，再經(jīng)log2變換，轉(zhuǎn)換數(shù)值范圍為0-10之間；

• 圖中點(diǎn)的顏色用于標(biāo)出顯著差異的OTU的類型；本實(shí)驗(yàn)以Soil為對(duì)照，分兩次比較篩選到了Root和Rhizosphere中顯著富集的OTU，再將這兩組富含OTU中的共有部分標(biāo)為青色(RR OTUS，即根和根際均富集的OTU)；而只在Root中特異顯著富含的標(biāo)為藍(lán)色(Root OUTs)；只有Rhizosphere中特異富集的OTU標(biāo)為粉色；

• 圖中的虛線和數(shù)字是各組的坐標(biāo)系刻度，方便讀出每個(gè)點(diǎn)在三者中的比例；

• 圖中點(diǎn)的位置代表該豐度在三個(gè)組中的相對(duì)比例；以圖中唯一的粉色點(diǎn)為例，它偏向于右角的根際組，在此組中豐度最高，采用等邊三角形法可讀出Rhizosphere在三組間的比例為50%左右，相當(dāng)于其它兩者之和，因此為根際組中特異顯著富集的OTU；

• 三元圖中用顏色標(biāo)出了三組顯著集的OTU，下面用餅形圖進(jìn)一步補(bǔ)充了這三組的物種分類門水平組成，便于觀察變化的是那一類菌；

圖表結(jié)果：與土壤相比，根中有許多特異富集的OTU，它們主要是beta或gama變形菌門；根際中富集的OTU大部分與根中相同，且主要來(lái)自于擬桿菌門(bacteroidetes)；根際中特異富集的OTU只有1個(gè)，來(lái)自放線菌門(Actinobacteria)。

經(jīng)驗(yàn)和技巧：本圖實(shí)際上是用三元圖代替了Root和Rhizosphere顯著富集OTU比較的Venn圖，圖中青色為兩組共有的部分，藍(lán)和粉為特有的部分。同時(shí)將每個(gè)OTU在三組間的相對(duì)關(guān)系和平均豐度展示出來(lái)，信息量大，感覺(jué)上比Venn圖更直觀和可靠。結(jié)合餅形圖可進(jìn)一步顯示差異OTU的分類情況，如門、綱、目、科或?qū)俚燃?jí)別，使發(fā)現(xiàn)的規(guī)律一目了然。

常見(jiàn)問(wèn)題

為什么有些點(diǎn)更接近各組的頂點(diǎn)，卻不是顯著富集的OTU？
因?yàn)橛?jì)算是否顯著富集的OTU，不僅與OTU相比對(duì)照組富集倍數(shù)有關(guān)，還有測(cè)序量、組內(nèi)樣品間的重復(fù)情況等有關(guān)，只有綜合多方面因素統(tǒng)計(jì)，并通過(guò)人為設(shè)計(jì)的顯著性P-value值(常用0.05, 0.01或0.001)時(shí)才被記為顯著富集的OTU。

物種分類學(xué)名稱不認(rèn)識(shí)
我也認(rèn)識(shí)的不多，見(jiàn)的越多，認(rèn)識(shí)的越多。起碼常見(jiàn)的幾個(gè)高豐度的門要認(rèn)識(shí)，如Proteobacteria變形菌門、Actinobacteria放線菌門、Bacteroidetes 擬桿菌門和Firmicutes厚壁菌門一定要認(rèn)識(shí)。

上圖中物種注釋中有門、有綱，是怎么回事？
除Proteobacteria以外都是門水平注釋，由于Proteobacteria豐度極高，因此作者將變形菌門中高豐度的alpha, beta, gamma綱單拿出來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明發(fā)現(xiàn)的規(guī)律，這種方法在分析結(jié)果中較常用。

附圖注原文：
Figure 3. OTU Enrichment at the Barley Root/Soil Interface Ternary plots of all OTUs detected in the data set with RA > 0.5% in at least one sample in (A) Hordeum vulgare ssp. spontaneum, (B) H. vulgare ssp. vulgare Landrace, and (C) H. vulgare ssp. vulgare Modern. Each circle represents one OTU. The size of each circle represents its relative abundance (weighted average). The position of each circle is determined by the contribution of the indicated compartments to the total relative abundance. Dark blue circles mark OTUs significantly enriched in the root microhabitat (Root_OTUs, FDR, p < 0.05), magenta circles mark OTUs significantly enriched in the rhizosphere microhabitat (Rhizo_OTUs, FDR, p < 0.05), and cyan circles mark OTUs significantly enriched in both microhabitats (RR OTUs, FDR, p < 0.05).

示例2. 雙三無(wú)圖展示不同區(qū)域特異OTU，同對(duì)比較基因型間變化

Zgadzaj, R., et.al., 2016 .PNAS?
這篇文章分析了百脈根根瘤的微生物組成，同時(shí)在根瘤缺失突變體條件下發(fā)現(xiàn)根和根際微生物均有較大差異的變化。
文中正文兩個(gè)組圖中使用了3個(gè)三元圖，附錄中5個(gè)圖使用了10個(gè)三元圖。純分析發(fā)的PNAS。可見(jiàn)三元圖很有市場(chǎng)。

圖4.A/B 三元圖展示同一基因型百脈根不同取樣區(qū)域/生態(tài)位(Compartment)中特異OTU。
C/D 用箱線圖進(jìn)一步展示上面發(fā)現(xiàn)的每類顯著富集OTU的總體相對(duì)豐度

圖中元素解釋，以A圖為例

• 最上方的黑體加粗Wild-type表示此圖的材料類型為野生型，與B圖中的Mutant突變體對(duì)應(yīng)；

• 圖中三角頂點(diǎn)分別為三種compartment，括號(hào)中數(shù)量為此組中顯著富集的OTU數(shù)量；

• 圖中點(diǎn)的大小代表三組樣品的組內(nèi)平均值，再求平均值的相對(duì)豐度，

• 位置代表在三組中相對(duì)比例，離那個(gè)頂點(diǎn)近就是其在此頂點(diǎn)組相對(duì)于其它組更高；

• 顏色代表OTU在三組中兩兩比較的顯著富集情況，與上圖只比較了兩次不同；此圖比較了6次，以Soil特異富集的棕色OTU為例說(shuō)明：先進(jìn)行Soil與Root比較確定Soil中顯著富集的OTU，再將Soil與Rhizosphere比較確定Soil中顯著富集的OTU，再將這兩組顯著富集OTU取交集，并將圖中相應(yīng)的點(diǎn)標(biāo)記為棕色；同理另外兩組Root和Rhizosphere中標(biāo)記顯著富集的OTU，都是需要兩次比較，再取并集得出來(lái)的。可見(jiàn)此圖的計(jì)算過(guò)程有多大的工作量。圖中其它非兩次比較顯著富集共有OTU均標(biāo)為灰色，作為背景色。

• 下面的箱線圖對(duì)應(yīng)上方的三元圖，展示這些找到的各compartment特異的OTU在不同部分中的相對(duì)豐度分布；

圖表結(jié)果：圖中顯示了各實(shí)驗(yàn)組中相對(duì)于其它兩組特異富集的OTU的數(shù)量和相對(duì)豐度情況，而且看到了野生型(A)和突變體(B)中明顯的變化，如突變體中根特異的OTU減少，而根際特異增加這種明顯的樣式，以說(shuō)明該基因?qū)Ω透H微生物組的影響。

經(jīng)驗(yàn)和技巧：三元圖三組特異富集圖(本圖樣式)，本質(zhì)上是6次兩兩比較和三次韋恩圖比較的結(jié)果，信息高度概括，并從多方面展示，非常值得使用；同時(shí)兩個(gè)三元圖并列，讓讀者去找差異，即讓讀者參與，又讓發(fā)現(xiàn)的差異深入人心；本圖結(jié)合箱線圖，進(jìn)一步展示找到的差異，從豐度水平進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果更直觀。

附圖注原文：
Fig. 4. Ternary plots depicting compartment RA of all OTUs (>5 ‰) for WT samples (A; WT; n = 73) and mutant samples (B; nfr5-2, nfr5-3, nin-2, and lhk1-1; n = 118) across three soil batches (CAS8–CAS10). Each point corresponds to an OTU. Its position represents its RA with respect to each compartment, and its size represents the average across all three compartments. Colored circles represent OTUs enriched in one compartment compared with the others (green in root, orange in rhizosphere, and brown in root samples). Aggregated RAs of each group of enriched OTUs (root-, rhizosphere- and soil-enriched OTUs) in each compartment for the WT samples (C; WT; n = 73) and mutant samples (D; nfr5-2, nfr5-3, nin-2, lhk1-1; n = 118) are shown. In each compartment, the difference from 100% RA is explained by OTUs that are not significantly enriched in a specific compartment.

Reference

http://baike.baidu.com/item/%E4%B8%89%E5%85%83%E7%9B%B8%E5%9B%BE

https://en.wikipedia.org/wiki/Manhattan_plot

Origin繪制三元圖 http://jingyan.baidu.com/article/a24b33cd1226f919fe002b2c.html

Bulgarelli, D., et al. (2015). “Structure and function of the bacterial root microbiota in wild and domesticated barley.” Cell Host Microbe 17(3): 392-403.

Zgadzaj, R., Garrido-Oter, R., Jensen, D.B., Koprivova, A., Schulze-Lefert, P. and Radutoiu, S., 2016. Root nodule symbiosis in Lotus japonicus drives the establishment of distinctive rhizosphere, root, and nodule bacterial communities. Proceedings of the National Academy of Sciences, 113(49), pp.E7996-E8005.

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總結(jié)

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