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做lncRNA/circRNA分子海綿研究，您需要了解這些技術(shù)：

1. Northern blot

2. RACE

3. FISH

4. RIP

5. RNA pull down

6. RAP/TRAP

7. 雙熒光素酶檢測

1． Northern blot（RNA印記技術(shù)）

技術(shù)應(yīng)用：

1.定性及定量分析基因轉(zhuǎn)錄水平差異；

2.檢測目的基因是否具有可變剪切產(chǎn)物或者重復(fù)序列。

技術(shù)原理：

提取質(zhì)量良好的RNA樣品，并將其固定在硝酸纖維膜或尼龍膜等固相上，加入標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行雜交。按照堿基互補(bǔ)配對原則，核酸探針會與固相上的RNA同源序列進(jìn)行互補(bǔ)，加入顯色系統(tǒng)即能顯示出雜交信號，通過檢測信號的有無、強(qiáng)弱可以對樣品定性、定量分析。

技術(shù)要點：

需要質(zhì)量好的，且表達(dá)量高的RNA樣品，可以先做QPCR檢測。

2． RACE（cDNA 末端快速擴(kuò)增技術(shù)）

技術(shù)應(yīng)用：

獲得lncRNA全長

RACE是一種基于PCR 從低豐度的轉(zhuǎn)錄本中快速擴(kuò)增cDNA的5'和3'末端的有效方法，通過測序可獲得目的mRNA的全長序列。

技術(shù)要點：

需要質(zhì)量好的RNA，多挑克隆以獲得最長最有可能的RNA片段。

3． FISH（熒光原位雜交）

使用特異性探針對RNA進(jìn)行熒光標(biāo)記，適用于mRNA/lncRNA/miRNA在細(xì)胞/組織中的表達(dá)定位檢測。

技術(shù)應(yīng)用：

1.用于組織/細(xì)胞miRNA/lncRNA/circRNA的表達(dá)定位檢測；

2.用于組織/細(xì)胞lncRNA-miRNA，circRNA-miRNA共定位檢測；

3.用于細(xì)胞倍性檢測。

技術(shù)要點：

探針特異性要好。

4． RIP（RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀）

RIP是研究細(xì)胞內(nèi)RNA與蛋白結(jié)合情況的技術(shù)，是了解轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)動態(tài)過程的有力工具，能幫助我們發(fā)現(xiàn)miRNA的調(diào)節(jié)靶點，miRNA/lncRNA/circRNA的結(jié)合蛋白如AGO2等。

技術(shù)應(yīng)用：

1.內(nèi)源檢測miRNA與靶基因3’UTR區(qū)的結(jié)合（miRNA-mRNA-AGO2）；

2.內(nèi)源檢測lncRNA/circRNA-miRNA-AGO2的結(jié)合。

技術(shù)要點：

準(zhǔn)備5*10E7個以上細(xì)胞，保證細(xì)胞狀態(tài)良好以最大化模擬正常生理狀態(tài)下的RNA與蛋白間的相互作用。

5． RNA pull down(體外研究蛋白質(zhì)與RNA互作)

使用體外轉(zhuǎn)錄法表及生物素RNA探針，然后與胞漿蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白復(fù)合物。該復(fù)合物可與鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠結(jié)合，從而與孵育液中的其它成分分離。復(fù)合物洗脫后，通過WB或MS檢測特定的RNA結(jié)合蛋白是否與RNA相互作用。

技術(shù)應(yīng)用：

體外研究蛋白與RNA相互作用關(guān)系。

技術(shù)要點：

在實驗之初，需先獲得目的miRNA/lncRNA/circRNA（調(diào)取/合成），設(shè)計探針并進(jìn)行生物素標(biāo)記。

6． RAP/TRAP (RNA antisense Purification)

RAP方法是通過針對調(diào)控RNA設(shè)計互補(bǔ)生物素探針組，將RNA拉下來以后，與其共同作用的RNA或蛋白質(zhì)（RBPs）就會同時被純化獲取，最后將提取的RNA做高通量測序或QPCR，從而得到與目標(biāo)RNA互作的RNA類型；與此同時，RBPs可以開展western blot驗證或者M(jìn)S鑒定未知蛋白（RAP-MS）。

簡單來說就是RAP是用circ/lncRNA的反向互補(bǔ)探針組去拉靶circ/lncRNA，再一起把結(jié)合在circ/lncRNA上的miRNA（和蛋白）拉下來，做測序或者qPCR。

如果lncRNA/此人從RNA的QPCR（△ct<12），表達(dá)太低，就要用TRAP。TRAP是包含了2個載體，一個是構(gòu)建ncRNA-ms2融合RNA表達(dá)載體，另一個是GST-MS2蛋白融合表達(dá)載體。MS2蛋白結(jié)合ms2頸環(huán)序列，GSH磁珠拉下MS2-GST，再進(jìn)行檢測。

技術(shù)應(yīng)用：

內(nèi)源檢測RNA與RNA，或RNA與蛋白相互作用關(guān)系。

技術(shù)要點：

需要質(zhì)量好的，且本底表達(dá)量高的RNA樣品，如本底表達(dá)量低，需要升級為TRAP檢測。

7． Luciferase（雙熒光素酶檢測）

Luciferase是miRNA-靶基因研究中運用的最多的技術(shù)。

值得注意的是，對于lncRNA-miRNA，circRNA-miRNA吸附的研究，做Luciferase實驗的時候還需要考慮到以下因素：挑選的lncRNA和circRNA本身是否具備作為分子海綿的功能。

比如lncRNA表達(dá)于細(xì)胞核內(nèi)而不在胞質(zhì)，或者它們與AGO2蛋白沒有結(jié)合（AGO2是lncRNA/circRNA發(fā)揮海綿作用的指示蛋白，分別與吸附的miRNA形成circRNA/lncRNA-miRNA-AGO2蛋白的三元復(fù)合物）。

所以在做雙熒光素酶檢測之前，你需要先做以下工作：

1.RIP-qPCR：檢測lncRNA/circRNA是否與AGO2蛋白結(jié)合。

2.FISH：查看lncRNA/circRNA與miRNA的表達(dá)是否存在共定位。

風(fēng)險提示：

由于雙熒光素酶載體不能成環(huán)，所以做circRNA/miRNA檢測時并不能完全模擬細(xì)胞內(nèi)環(huán)境。

技術(shù)應(yīng)用：

1.外源檢測miRNA與靶基因RNA3’UTR的結(jié)合；（推薦）

2.外源檢測miRNA與lncRNA/circRNA的結(jié)合。

3.通常用工具細(xì)胞HEK-293（植物系統(tǒng)除外）細(xì)胞進(jìn)行，不需要目的細(xì)胞檢測。

技術(shù)要點：

兩個熒光素酶最好在同一個載體上，以做背景校正；靶向關(guān)系預(yù)測要精準(zhǔn)；miRNA的mimics最好帶熒光，以排除轉(zhuǎn)染效率問題。

以上檢測技術(shù)的適用性

總結(jié)成一張表：

如果每項檢測結(jié)果均能指向同一陽性結(jié)合結(jié)論，

那么恭喜你，分子海綿研究成功！

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總結(jié)

以上是生活随笔為你收集整理的rap技术原理_「水深坑多」做分子海绵，你还需要了解这些技术的全部內(nèi)容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問題。

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