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1、文章系統地介紹了4Pi-SMS系統的路徑、性能及配置等情況，并通過改進進一步增強其震動穩定性和重復性，并縮短時間周期。
2、文章利用建立的4Pi-SMS系統，通過實際的應用闡述了從樣品制備到獲得全細胞圖像和分析原始圖像數據，建立超分辨率3D數據集的過程，并在此基礎上，分析4Pi-SMS的優勢與不足。

近日，來自英國、美國、中國和德國的研究人員Jingyu Wang等人合作在《Nature Protocols》上發表了一篇名為“Implementation of a 4Pi-SMS super-resolution microscope”的文章。文中詳細介紹了4Pi-SMS儀器的光學機械組件的裝配、光路校準和性能測試。該協議還提供了如何制備測試樣品、操作該儀器以獲取全細胞圖像和分析原始圖像數據以重建超分辨率3D數據集的說明。此外，還提供了故障排除指南，并給出了預期結果的示例。除此之外，生產周期也盡可能的降低，未來具有良好的推廣和發展前景。

當前對于細胞及分子水平的研究，越來越受到顯微鏡分辨率的限制，傳統的白光和激光共聚焦的光斑尺寸無法達到這樣的分辨率，4Pi -SMS顯微技術是一種超分辨率熒光成像技術，與SMLM相比，4Pi檢測在XY方向的定位精度提高了一倍，Z軸方向的分辨率提高了近6倍。本研究中對于如何組裝、測試和操作4Pi-SMS顯微鏡進行詳細的說明。
研究中首先結合SMLM進行4Pi檢測，采用干涉PALM (iPALM) 3個干涉通道，然后采用4個4Pi-SMS干涉通道。在這種方法中，通過將模型函數擬合到單分子圖像上，利用傳統的SMLM技術確定分子的橫向XY位置。利用4Pi干涉效應，高精度地找到每個分子的軸向Z位置。為了達到所需的干涉對比度，兩個光路之間的光程長度差必須在單個發射器的相干長度內，通常為5-10 μm。同時，在每個目標后，在每個光路中故意添加散光。由散光引起的點擴散函數(PSF)畸變允許分子的z-位置被分配到4Pi干涉圖的一個峰上，從而消除了軸向定位的模糊性。通過引入像散的概念，采用自適應光學方法對PSF進行成形，并對隨深度變化的樣品像差進行校正。

圖1顯示了4Pi-SMS檢測系統的光路圖。熒光發射由兩個相對的物鏡(OBJ0和OBJ1)收集，然后定向到兩個對稱的，相同的上和下光束路徑，各自的光束路徑通過寬頻消色差QWPs (QWP0和QWP1)，引入激發激光的二色鏡(DI0和DI1)，兩對透鏡將物鏡后瞳平面成像到DMs (DM0和DM1)上，并最終形成非偏振50/50分光鏡多維數據集(NPBS)。

相對于發射路徑，系統的激發裝置安裝在垂直面板的另一側，如圖2所示。圖1b中給出了激發路徑的光學布局。激發光通過單模保偏光纖傳輸到系統。從光纖發射的光經過準直，并沿著一條直線通過一個矩形光圈，然后一個透鏡將激發光聚焦到OBJ1的后光圈。矩形孔徑用于限制樣品處的照明面積，從而避免了未成像區域的不必要的光漂白，并減少了來自自發熒光和散射的背景。光束尺寸、光圈尺寸和聚焦透鏡的選擇使樣品得到更均勻的照明。激發路徑還包括兩個倒裝鏡，可以引導激發光束通過另一個路徑，從而在樣品處形成一個大的照明區域，用于樣品定位和識別。
此外，激發路徑包括用于實時目標對準的近紅外激光束(LS1，圖1b)。近紅外光束從一根光纖發射出來，相對于激發光沿相反的方向傳播，然后被二向色鏡分離，定向到攝像機(CAM1)上。柱面鏡頭(CY0)在近紅外光束路徑增加散光之前聚焦到相機。目標的相對橫向位置可以通過觀察攝像機上的聚焦點來跟蹤。柱面透鏡所引入的散光能夠跟蹤目標的軸向位置。從這個相機的圖像是用來糾正目標位置通過閉環控制。
研究者利用市場上可獲得的光學機械部件構建該系統，同時從振動穩定性，重復性和便捷性三個方面對其進行反復的實驗和改進。在應用的過程中，發現該系統具有顯著的3D各向分辨率，能夠在細胞生物學中國提供接近于電子顯微鏡的免疫熒光標記特異性的三維分辨率；此外，可以很容易地添加多色成像，并且與使用探針切換的任何基于定位的方法進行兼容；該系統還允許使用自適應光學對整個細胞的厚度進行成像；穩定性較好，且后期校準維護相對簡單。同時，也存在著局限性，系統的低時間分辨率排除了活細胞成像的可能性，限制了樣品的物理空間。總的來說，這個系統是一個優秀的選擇，對于應用程序，能夠提供需要的卓越的3D分辨率。教授介紹

Joerg Bewersdorf，美國耶魯大學醫學院教授，細胞生物學與生物醫學工程教授。長期以來一直在超分辨率光領域做出貢獻顯微鏡的發展以及這些技術在細胞生物學問題中的應用。
當前實驗室開發了超高分辨率的STED顯微鏡，單分子定位顯微鏡（FPALM / PALM / STORM / PAINT等）和泛擴展顯微鏡（pan-ExM）技術。該團隊正在積極開發以提高這些成像技術的功能（速率、3D分辨率、穩定性、多色標記），擴大超分辨率顯微鏡的應用范圍，并嘗試將它們應用于一系列生物學問題。目前已在Nature子刊等雜志發表了多篇高影響力的論文。參考文獻
Wang, J., Allgeyer, E.S., Sirinakis, G. et al. Implementation of a 4Pi-SMSsuper-resolution microscope. Nat Protoc (2020).https://doi.org/10.1038/s41596-020-00428-7.

總結

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