在CRISPR/Cas9基因組編輯實驗中，如果你已經構建好了gRNA表達載體，并利用Cas9將它引入了目標細胞，那么恭喜你！成功就在眼前，指日可待。下一步，你還要驗證一下，看看細胞的編輯是否如你所愿。在此，一些專家給你提了一些建議。

驗證的方法將因物種和編輯類型而異。在這里，我們主要關注二倍體的哺乳動物細胞，不過許多原理也同樣適用于其他的模式生物。

在細胞中引入Cas9和gRNA，將帶來混合的細胞群體。雙鏈斷裂（DSB）產生之后，細胞內的修復機制通過非同源末端連接（NHEJ）或同源定向修復（HDR）來起作用。哺乳動物細胞的修復以NHEJ為主，這就帶來了插入缺失的錯誤。不過引入的插入缺失存在異質性，而等位基因編輯的頻率也有所不同。有的細胞沒有被編輯，有的只有一個等位基因被編輯，而有的則有兩個。同源定向修復則需要修復模板的存在。

驗證過程的第一步是快速評估是否有一定量的細胞被編輯。對于插入缺失而言，可通過錯配切割分析來觀察。對于HDR，往往可通過限制圖譜的改變或報告基因的讀數來觀察。對于缺失，你可以通過特殊設計的PCR引物來判斷。

一旦你知道有一部分細胞經過了編輯，那么你可以繼續創建克隆細胞系。利用連續稀釋，來分離單個細胞，接著進行擴增產生細胞系。如果你的質粒上有熒光蛋白的標記，那么可通過FACS來富集含有Cas9和gRNA的細胞。擴增后，分析每個細胞系，并測序目的區域，以驗證編輯是否如你所愿。如果可能，你還可以開展western blot。

錯配切割分析

錯配切割分析是一種快速而簡單的插入缺失檢測方法。此過程中通常使用Surveyor核酸酶，因為它切割DNA雙鏈3’端的任何錯配。它能夠檢測多達12個核苷酸的插入缺失，對頻率低至1/32的突變敏感。

此分析通常包含四個步驟：1. PCR擴增目標區域；2. 變性并再次雜交，讓突變型和野生型的鏈退火；3. 用Surveyor核酸酶處理退火的DNA，以切割異源雙鏈；4. 瓊脂糖凝膠電泳分析DNA。在這個例子中，兩個+gRNA的泳道都包含了預期大小的片段，表明gRNA成功產生了插入缺失。這種分析通常是半定量的，你可以看出gRNA1似乎比gRNA2更有效。

（圖片來自Addgene）

檢測同源定向修復

如果你希望利用HDR來實現突變，那么你最好先確定gRNA是否能高效切開你的目標序列。這可以參考上面的錯配切割分析。一旦你選擇了最佳的gRNA，就可以引入它和Cas9以及你的修復模板。

在設計你的HDR修復模板時，事先要計劃好整合事件的檢測。舉個例子，你需要有目的地引入或刪除限制性酶切位點，這會改變PCR產物的酶切。或者，你加入一個報告元件，以便在DNA、RNA或蛋白水平檢測HDR。如果整合了大的插入或缺失，那么也可通過PCR產物的大小變化來檢測。如果單核苷酸的變化引入或刪除了限制性酶切位點，那么可通過酶切來快速判斷。否則，只能通過Sanger測序、新一代測序或數字PCR來檢測。

HDR事件的頻率往往不及插入缺失，因此你可能需要篩選比較多的克隆。這個具體數量要取決于你的轉染效率和HDR頻率。如果你的轉染效率是40%，而HDR頻率是5%，那么2%的細胞將產生重組區域。因此，你至少要篩選50個克隆。如果你能夠利用標記選擇出成功轉染的細胞，那么篩選的數量就能大大減少。

通過PCR來檢測缺失

大多數的缺失是利用兩個gRNA來創建的，它們指導Cas9來切割DNA的中間區域。因此，缺失可以通過PCR來檢測，擴增時使用在缺失區域兩側的引物。在這個例子中，我們可以看出，克隆1、5和7是缺失的雜合子，而克隆4是缺失的純合子。

新一代測序也是個選擇

當然，如果你的實驗室有資源，你也能利用新一代測序（NGS）來定量評估基因組編輯。當你有大量的樣品，或希望同時檢測脫靶效應，那么NGS是個好的選擇。在使用這種方法時，你需要有一組對照細胞，這樣你才能比較編輯前和編輯后樣品的測序讀取。CRISPResso等軟件能幫助你開展數據分析。

值得一提的是，這篇文章中的方法并不是只針對CRISPR的，同樣適用于TALEN或鋅指核酸酶的編輯。無論你采用什么方法，驗證編輯的時間都是值得花的。磨刀不誤砍柴工！

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總結

以上是生活随笔為你收集整理的克隆需要验证_[实验技巧]CRISPR实验中如何验证编辑？的全部內容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問題。

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