俗話說(shuō)，一個(gè)生物學(xué)博士，要跑滿(mǎn)1000面膠才能畢業(yè)。今天特邀實(shí)驗(yàn)室博三大師兄，和大家聊一聊WB內(nèi)參那些小事。

選擇好合適并且好跑的內(nèi)參，WB實(shí)驗(yàn)也就成功了一半。

1. 什么是內(nèi)參？

內(nèi)參即內(nèi)部參照，一般是指由管家基因編碼表達(dá)的蛋白，它們?cè)诟鹘M織和細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)恒定，在檢測(cè)蛋白的表達(dá)水平變化時(shí)常用它來(lái)做參照物

2. 內(nèi)參的作用是什么？

（1）校正蛋白樣品定量以及上樣過(guò)程中的誤差，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性

（2）作為空白對(duì)照，檢測(cè)WB過(guò)程中蛋白轉(zhuǎn)膜是否完全以及發(fā)光顯色體系是否正常

3. 如何選擇內(nèi)參？

（1）根據(jù)樣本的種屬來(lái)源選擇，如哺乳動(dòng)物或者植物等

（2）考慮目的蛋白的分子量大小，一般需要與目的蛋白的分子量相差5kd以上

（3）根據(jù)蛋白表達(dá)位置選擇不同的內(nèi)參，不同的細(xì)胞器中選擇的內(nèi)參也不同

（4）內(nèi)參的選擇需要考慮試驗(yàn)處理?xiàng)l件對(duì)于內(nèi)參表達(dá)的影響：

• 由于GAPDH是糖酵解過(guò)程中的酶，所以關(guān)于糖代謝的研究（如糖尿病模型）不能選擇GAPDH作為內(nèi)參；而某些細(xì)胞中，缺氧也會(huì)影響GAPDH的表達(dá)，此時(shí)也不可以選擇GAPDH作為內(nèi)參
• 做細(xì)胞骨架相關(guān)的研究時(shí)不能選擇β-actin作為內(nèi)參
• 做細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)時(shí)，TATA binding protein和Lamin B會(huì)發(fā)生變化，此時(shí)不可以選擇其作為內(nèi)參

最后，是一些個(gè)人實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的感悟和想法。

我自己是在做腫瘤方面的課題，除了做糖代謝方面最好不選擇GAPDH作為內(nèi)參外，將腫瘤組織與正常組織相比時(shí)，最好也不要選擇GAPDH作為內(nèi)參，因?yàn)楹芏嗄[瘤組織中的GAPDH相對(duì)于正常組織是高表達(dá)的，并且有文獻(xiàn)報(bào)道GAPDH可以作為腫瘤標(biāo)志物。

一般情況下，做全細(xì)胞和細(xì)胞質(zhì)的WB實(shí)驗(yàn)時(shí)，選擇β-actin基本能滿(mǎn)足大部分的需要。而考察細(xì)胞核樣品時(shí)，由于Histone H3是染色體的組成型表達(dá)組分，表達(dá)相當(dāng)穩(wěn)定，并且特別好跑，可以算是細(xì)胞核內(nèi)參的首選

另外，針對(duì)一些特定的內(nèi)參，蛋白上樣量超過(guò)一定的量時(shí)，出來(lái)的條帶可能不會(huì)有顯著的差別。以前看過(guò)一篇文獻(xiàn)講的應(yīng)該是β-actin，當(dāng)上樣量超過(guò)20 μg時(shí)，條帶灰度不會(huì)呈線性的增加。因此，在做WB校正時(shí)，調(diào)節(jié)合適的上樣量也是影響實(shí)驗(yàn)成功較大的一個(gè)因素。

原文發(fā)表于 Island Academic Express

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總結(jié)

以上是生活随笔為你收集整理的3蛋白wb_老司机手把手教你选WB内参的全部?jī)?nèi)容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問(wèn)題。

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