? ? pET系統(tǒng)是目前應(yīng)用最為廣泛的原核表達(dá)系統(tǒng)，已經(jīng)成功地在大腸桿菌中表達(dá)了各種各樣的異源蛋白。經(jīng)過與使用過和正在使用這個系統(tǒng)的科學(xué)家的交流，我們發(fā)現(xiàn)了一些在使用pET系統(tǒng)的過程中以及原核表達(dá)中的一些常見問題。在此，我們選取了其中一些比較有代表性的問題，附上我們的建議改進方案，并期待和你一起分享成功的喜悅。

原核表達(dá)研究者關(guān)心的10個問題：

1.目的蛋白總是以不可溶的形式出現(xiàn)真是令人煩惱

????在大腸桿菌中表達(dá)的異源蛋白經(jīng)常發(fā)生錯誤的折疊，并聚集成為包涵體。經(jīng)過誘導(dǎo)，目的蛋白通常可達(dá)細(xì)胞總蛋白的50%以上。雖然有一定比例的蛋白以可溶的單體形式存在，而多達(dá)95%（甚至更多）的蛋白則在包涵體中。實踐中，有很多實驗室采取降低誘導(dǎo)溫度，例如 25–30°C (Burton et al. (1991)Prot.Exp. Purif.2, 432-441)，或降低IPTG濃度(0.01–0.1mM)并延長誘導(dǎo) 時間，還 有采用特別的培養(yǎng)基 (Blackwell and Horgan (1991) FEBS Lett. 295, 10-12)等方法獲得更多的可溶蛋白。隨著越來越多的蛋白折疊途徑被闡明，相信會出現(xiàn)更多有效的增加可溶性目的蛋白的實驗方法。然而，讓目的蛋白以包涵體形式聚集也并非總是壞事。不溶態(tài)在某些情況下非常有利：

a. 形成包涵體是目的蛋白表達(dá)量很高的表現(xiàn)。

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總結(jié)

以上是生活随笔為你收集整理的原核表达常见问题解答的全部內(nèi)容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問題。

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