1. cDNA產量的很低

可能的原因：

*RNA模板質量低

*對mRNA濃度估計過高

*反應體系中存在反轉錄酶抑制劑或反轉錄酶量不足

*同位素磷32過期

*反應體積過大，不應超過50μl

2. 擴增產物在電泳分析時沒有條帶或條帶很淺

*常見的原因在于您的反應體系是PCR的反應體系而不是RT-PCR的反應體系

*與反應起始時RNA的總量及純度有關

*建議在試驗中加入對照RNA

*一鏈的反應產物在進行PCR擴增時，在總的反應體系中的含量不要超過1/10

*建議用Oligo(dT)或隨機引物代替基因特異性引物(GSP)用于一鏈合成。由于RNA模板存在二級結構，如環(huán)狀結果，有可能導致GSP無法與模板退火；或SSⅡ反轉錄酶無法從此引物進行有效延伸。

*目的mRNA中含有強的轉錄中止位點，可以試用以下方法解決：

a. 將一鏈的反應溫度提高至50℃。

b. 使用隨機六聚體代替Oligo(dT)進行一鏈反應。

3. 產生非特異性條帶

*用RT陰性對照檢測是否被基因組DNA污染。如果RT陰性對照的PCR結果也顯示同樣條帶，則需要用DNase I重新處理樣品。

*在PCR反應中，非特異的起始擴增將導致產生

非特異性結果。在低于引物Tm 2至5℃的溫度下進行退火，降低鎂離子或是目的DNA的量將減少非特異性結果的產生。

*由于mRNA剪切方式的不同，根據(jù)選擇引物的不同將導致產生不同的RT-PCR結果。

4. 產生彌散(smear)條帶

*在PCR反應體系中一鏈產物的含量過高

*減少引物的用量

*優(yōu)化PCR反應條件/減少PCR的循環(huán)次數(shù)

*在用DNase處理被DNA污染的RNA樣品時，其產生的寡核苷酸片段會產生非特異性擴增，一般會顯示為彌散背景。

5. 產生大分子量的彌散條帶

*大多數(shù)情況下是由于退火溫度過低而導致的非特異性的起始及延伸產生的

*對于長片段的PCR，建議將反應體系中cDNA的濃度稀釋至1:10(或1:100-1:200)

6. 在無反轉錄酶的情況下，對照RNA獲得擴增結果

*通常是由于對照RNA中含有痕量DNA而導致的。由于進行體外轉錄時不可能將所有的DNA模板消除。建議可將一鏈cDNA稀釋1:10、1:100、1:1000倍以消除DNA污染所造成的影響。

*有可能是引物二聚體的條帶

7. 擴增產物滯留在加樣孔中

*有可能是由于模板量過高而導致PCR結果產生了高分子量的DNA膠狀物。建議將一鏈結果至少稀釋100倍再進行二次擴增。

*另外，在二次PCR時使用的退火溫度如果比引物的Tm值低5℃，可以將退火溫度適當增高或進行熱啟動以提高特異性。

8. SSⅢ與SSⅡ有何不同？

*具有更高的熱穩(wěn)定性(達50℃)

*具有更長的半衰期(達220分鐘)

*對PCR無抑制

*干冰運輸

*Tdt活性更低

9. 為什么有人更喜歡用SSⅢ而不是ThermoScript？

ThermoScript如果保存不當會引起活性很快降低，SSⅢ則更穩(wěn)定。

10. 為什么使用基因特異性引物(GSP)？

GSP在擴增低豐度的轉錄本時是好的。OligodT引物建議用于高質量RNA及全長轉錄本的逆轉錄；隨機引物用于mRNA段的逆轉錄。

11. 什么情況下需要使用RNase H？

在一輪PCR中RNA/DNA雜合體不能正常變性時

12. 根據(jù)不同的目的選擇不同的系統(tǒng)：

目的 建議

RT與PCR使用不同的引物

或需要靈活選擇PCR DNA聚合酶 兩步法RT-PCR系統(tǒng)

高靈敏度 一步法或兩步法RT-PCR系統(tǒng)

高特異性 含有適當?shù)腄NA聚合酶的兩步法RT-PCR系統(tǒng)

或具有高保真Platinum Taq酶的一步法RT-PCR系統(tǒng)

高保真度 含有Pfx Taq酶的兩步法RT-PCR系統(tǒng)

長的反轉錄結果 通常使用兩步法RT-PCR系統(tǒng)可達到結果

含Elongase酶的一步法RT-PCR系統(tǒng)

總結

以上是生活随笔為你收集整理的二次扩增产物条带弥散_PCR实验操作常见解决方法的全部內容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問題。

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