人類基因組上最初轉(zhuǎn)錄生成的是前體mRNA (pre-mRNA)。這些未成熟的mRNA需要經(jīng)過一定的加工，如剪接 (去除內(nèi)含子)、在5'端加一個7-甲基鳥苷酸“帽子”，及在3'端加上一個多聚腺苷酸尾，最后形成較短的有功能的成熟mRNA。

因此pre-mRNA剪接是真核生物基因表達的關(guān)鍵步驟。當剪接位點發(fā)生突變，或剪接錯誤地發(fā)生在其它符合剪接位點 (Splice site, SS)特征的堿基上，就會導(dǎo)致外顯子缺失或內(nèi)含子保留，進而引起基因表達異常，或蛋白質(zhì)功能的改變。SS變異是許多疾病常見的致病變異。

SS (GU, AG堿基), 分支位點 (Branch site, BS。A堿基), 紅色箭頭親核反應(yīng)(Nucleophilic attacks)

如何精準地從pre-mRNA中去除內(nèi)含子？這個過程由一種被稱為剪接體的大而動態(tài)的RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物催化和控制，其中包含了5個小的”核”核糖核蛋白顆粒 (Small nuclear ribonucleoprotein particles, snRNPs。包含snRNA及其他組件蛋白)和幾十個蛋白質(zhì)因子，并從頭組裝在每個pre-mRNA底物上。在剪接體組裝過程中，pre-mRNA中的三個保守位置，即5′-SS、BS和3′-SS，由剪接體的組件特異性識別，允許發(fā)生兩步反式酯化反應(yīng)。

U1 snRNP識別5′-SS, U2 snRNP識別BS, U4/U6.U5 Tri-snRNP促進loops形成

切除3’-SS, Exon 1和Exon2對接成功

因此，U2 snRNP識別內(nèi)含子的BS序列是剪接體組裝過程中的一個關(guān)鍵事件。

SF1, U2AF65，E complex, UAP65-ATP, A complex, U2/BS helix (圖的中央)

注意上圖 (圖c)中U2復(fù)合物中的SF3B6蛋白

在哺乳動物細胞中，BS最初由SF1（mBBP）與U2AF65等識別，同時U1與5′-SS結(jié)合，共同形成第一個剪接體組裝中間體 (無ATP)，即復(fù)合物E (E complex)。UAP65-ATP等參與復(fù)合物E后，SF1等組件脫離，形成復(fù)合物A（A complex），并在BS和U2之間形成堿基互補配對作用 (U2/BS helix, 上圖中央)。

在后續(xù)剪接反應(yīng)中，復(fù)合物內(nèi)的多個組件精確地結(jié)合、重排和解聚，形成預(yù)組裝復(fù)合物U4/U6.U5 Tri-snRNP及其它完全組裝剪接體 (pre-B/B/Bact/B*/C/C*/P complex以及ILS復(fù)合物)，如下圖。

通過上面的介紹，我們知道U2識別內(nèi)含子的BS序列是剪接體組裝過程中的一個關(guān)鍵事件。但在哺乳動物中BS序列保守性差，僅通過堿基互補配對機制無法實現(xiàn)明確的內(nèi)含子識別。為了解析出該事件發(fā)生時的剪切體形態(tài)結(jié)構(gòu)，兩周前 (11月25日)歐洲分子生物學(xué)實驗室 (EMBL)和德國海德堡大學(xué)的研究人員在Science上發(fā)表了題為《Structural basis of branch site recognition by the human spliceosome》的研究型論文。研究人員分離了人類的17S U2 snRNP，并在體外重建其ATPD依賴性重塑和與前mRNA底物的結(jié)合。確定了一系列提供BS選擇過程快照的高分辨率（2.0-2.2?）結(jié)構(gòu)。底物結(jié)合的U2 snRNP表明SF3B6穩(wěn)定了BS:U2 snRNA雙鏈結(jié)構(gòu)，這有助于序列互補性差的內(nèi)含子的結(jié)合。與底物結(jié)合不耦合的ATP依賴性重塑以與BS識別競爭的構(gòu)象捕獲U2 snRNA，提供基于分支螺旋穩(wěn)定性的選擇機制。

HTATSF1穩(wěn)定17S U2 snRNP中的分支點相互作用的莖環(huán) (Branchpoint-interacting stem loop,?BSL)。作者對17S U2 snRNP的重建表明，HTATSF1^RRM結(jié)合在由SF3B1的熱重復(fù)序列H15和H16形成的疏水口袋中。相鄰的H16和H17重復(fù)序列形成 HTATSF1LH的C端接口，包括殘基239-251。

HTATSF1^RRM結(jié)合在由SF3B1的熱重復(fù)序列H15和H16形成的疏水口袋中

HTATSF1LH的C末端指向BSL，可能與已知的結(jié)合SF3B1ULM基序的HTATSF1UHM結(jié)構(gòu)域相類似。HTATSF1的兩個結(jié)構(gòu)域與SF3B1形成穩(wěn)定的界面，并從兩側(cè)夾持U2 snRNA BSL，表明該瞬時RNA二級結(jié)構(gòu)具有直接的穩(wěn)定機制。

HTATSF1的兩個結(jié)構(gòu)域與SF3B1形成穩(wěn)定的界面，并從兩側(cè)夾持U2 snRNA?BSL

SF3B6穩(wěn)定A-like U2 snRNP(BS:U2 snRNA)中的分支螺旋結(jié)構(gòu)。17S和A-like U2 snRNP的比較表明，SF3B6和HTATSF1RRM與SF3B1HEAT的結(jié)合是互斥的，需要取代HTATSF1RRM才能穩(wěn)定對接SF3B6。當BPS寡核苷酸與17S U2 snRNP結(jié)合時，在SF3B1的H14和H15附近出現(xiàn)額外的密度。雖然SF3B6是SF3B復(fù)合物的穩(wěn)定成分，但在以前報道的SF3B復(fù)合物或U2snRNP的任何結(jié)構(gòu)中都沒有觀察到SF3B6。SF3B6與位于分支螺旋5’端的U2 snRNA結(jié)合，因此它定義了凸起的BP-A相對于分支螺旋末端的確切位置。

U2 snRNA的腺嘌呤A29與SF3B6的Y22殘基堆積在一起，放置在同一個口袋中。

基于以上的結(jié)構(gòu)分析，得到U2?snRNP識別分支位點的示意圖模型：

HTATSF1的解離在分支螺旋的形成和BMSL之間產(chǎn)生競爭。對弱的、次優(yōu)底物的排斥形成了remodeled U2 snRNP，它的靶向是一個廢棄的途徑。穩(wěn)定的底物逐漸形成分支螺旋。在沒有正確定位、凸出的BP-A的情況下，復(fù)合體被靶向一條廢棄的途徑。分支螺旋的生產(chǎn)導(dǎo)致復(fù)合物A的形成，其中U2snRNP在結(jié)構(gòu)上類似于A-like U2snRNP。

(A)17S、(B)A-like 和(C)remodeled U2 snRNP中U2snRNA的二級和三級結(jié)構(gòu)。

總結(jié)，U2識別內(nèi)含子的BS序列是剪接體組裝過程中的一個關(guān)鍵事件，SF3B6在穩(wěn)定分支螺旋方面發(fā)揮著以前未知的作用，這可能與U2 snRNA互補性較差的分支序列特別相關(guān)。本研究提供了U2 snRNP識別分支位點的復(fù)雜過程的幾個高分辨率快照，有助于更好地理解人類Pre-mRNA的剪接機制。

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總結(jié)

以上是生活随笔為你收集整理的Science | 从结构生物学的角度理解人类mRNA剪接体分支位点的识别的全部內(nèi)容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問題。

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