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近日，中山大學(xué)駱觀正課題組與上海科技大學(xué)季泉江課題組合作，在Cell Reports雜志發(fā)表了題為“Targeted genetic screening in bacteria with a Cas12k-guided transposase”的研究論文，開發(fā)了名為Site-specific Transposon-Assisted Genome Engineering （STAGE）的新方法，該方法允許在多種微生物（例如銅綠假單胞菌和肺炎克雷伯菌）中進行高通量的Cas12k介導(dǎo)的基因敲除篩選。在這里附上文獻詳解以饋讀者。

微生物基因組的多樣性使微生物種群能夠快速適應(yīng)不斷變化的環(huán)境。為了研究未探索的基因組功能，高通量基因組編輯和篩選是基因型-表型關(guān)系功能分析和了解細胞網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜性的主流方法。隨著高通量的DNA合成技術(shù)和高通量測序(NGS)的進步，并行產(chǎn)生準(zhǔn)確和特定突變的高通量方法已不是基因組規(guī)模分析的瓶頸。目前幾種高通量基因工程方法，例如Tn-seq、MAGE、TRMR和CREATE已被開發(fā)用于細菌中的快速基因組大規(guī)模誘變。Tn-seq已被廣泛應(yīng)用于不同細菌物種中，是構(gòu)建基因組規(guī)模的轉(zhuǎn)座子誘變文庫的經(jīng)典策略。然而，靶向非特異性基因組位點使得該方法無法構(gòu)建位點特異性誘變文庫，通常需要后續(xù)大量的篩選來分離所需的突變。相比之下，由同源重組介導(dǎo)的高通量基因工程方法（例如MAGE和TRMR）使得在大腸桿菌中位點特異性的基因組整合成為可能。然而由于其他細菌物種可能缺乏有效的噬菌體重組蛋白，使得這些方法在其他菌種中不像在大腸桿菌中那樣有效。最近，兩個CRISPR相關(guān)轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)被報道稱可在大腸桿菌中使用gRNA來介導(dǎo)高效和位點特異性基因組轉(zhuǎn)座，而不依賴于同源重組。鑒于其可編程性、高效率和可操作性，該技術(shù)是用于位點特異性基因組規(guī)模誘變的理想高通量基因工程工具。

銅綠假單胞菌中ShCAST系統(tǒng)的構(gòu)建

CRISPR-Cas12k引導(dǎo)的轉(zhuǎn)座酶系統(tǒng)是一種由Cas12k、sgRNA、TniQ/TnsBC轉(zhuǎn)座酶構(gòu)成的定向轉(zhuǎn)座系統(tǒng)。利用Cas12k/gRNA復(fù)合物的基因組識別和定位功能， TniQ/TnsBC能夠?qū)崿F(xiàn)藍藻細菌基因組的定向轉(zhuǎn)座。為了評估該系統(tǒng)是否適用于其他細菌物種，我們設(shè)計并構(gòu)建了一個基于雙質(zhì)粒的ShCAST系統(tǒng)，以鑒定該系統(tǒng)在銅綠假單胞菌中的整合效率。其中pCASTPA質(zhì)粒可以在L-阿拉伯糖誘導(dǎo)型啟動子PBAD的控制下表達TnsB、TnsC、TniQ和Cas12k蛋白，而pGTPA質(zhì)粒包含gRNA表達盒和轉(zhuǎn)座子供體DNA（圖1）。此外，反選擇標(biāo)記sacB也被組裝到兩個質(zhì)粒中，在蔗糖存在下sacB會變成致死基因，可用于轉(zhuǎn)座后的質(zhì)粒篩選。

圖1

我們將含有九個不同Spacer的pGTPA質(zhì)粒分別電穿孔到攜帶pCASTPA質(zhì)粒的銅綠假單胞菌PAO1菌株中。培養(yǎng)后通過使用與目標(biāo)基因組位點相鄰的引物和位于轉(zhuǎn)座子供體DNA內(nèi)的引物進行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)確認，在9個測試位點均發(fā)生了成功的轉(zhuǎn)座事件（圖2）。證明了雙質(zhì)粒的ShCAST系統(tǒng)可以應(yīng)用于銅綠假單胞菌。

圖2

之后為了仔細評估ShCAST系統(tǒng)在銅綠假單胞菌中的插入頻率，我們將eGFP作為轉(zhuǎn)座子供體DNA組裝到pGTPA質(zhì)粒中。在靶向rhlR和lasR基因時，分別在921個總菌落中觀察到10個明亮菌落，在657個總菌落中觀察到8個明亮的菌落。此外，定量PCR(qPCR)分析顯示，9個測試位點的整合效率范圍為10^-5到10^-2，與eGFP轉(zhuǎn)座分析的結(jié)果一致（圖3）。

圖3

此外為了進一步擴展ShCAST系統(tǒng)在不同細菌中的多功能性，我們將ShCAST系統(tǒng)應(yīng)用于肺炎克雷伯氏菌，這是一種重要的工業(yè)微生物和主要的人類病原體。與銅綠假單胞菌的結(jié)果相似，肺炎克雷伯菌基因組中的10個測試位點都成功地被轉(zhuǎn)座子DNA整合，但是整合的頻率相對較低。

ShCAST系統(tǒng)在銅綠假單胞菌和肺炎克雷伯氏菌中的低整合效率阻礙了成功轉(zhuǎn)座菌種的分離。因此我們試圖使用抗生素選擇來富集包含成功插入轉(zhuǎn)座DNA的陽性菌種。為了實現(xiàn)這一目標(biāo)，我們使用慶大霉素抗性基因作為轉(zhuǎn)座子供體DNA。并在菌種發(fā)生編輯后，在含有蔗糖和慶大霉素的Luria-Bertani(LB)板上選擇菌落。蔗糖用于去除含有游離質(zhì)粒或整合到細菌基因組中的質(zhì)粒的細胞，而慶大霉素用于篩選成功整合因此含有慶大霉素抗性基因的菌種（圖4）。

圖4

在用慶大霉素和蔗糖選擇后，銅綠假單胞菌中的所有測試基因都實現(xiàn)了高效率的富集。此外，隨機挑選三個菌落進行納米孔測序發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)座子供體DNA成功插入目標(biāo)位點，同時沒有檢測到脫靶整合或剩余質(zhì)粒。

STAGE突變文庫的設(shè)計與構(gòu)建

鑒于ShCAST系統(tǒng)的位點特異性轉(zhuǎn)座的能力和選擇后陽性轉(zhuǎn)座事件的高富集效率，研究試圖在銅綠假單胞菌中構(gòu)建一個集中的TF庫，以便對TF功能進行全面分析。我們根據(jù)NCBI和已有的基因注釋，將銅綠假單胞菌PAO1菌株中的593個帶注釋的TF確定為靶基因，為每個靶基因設(shè)計并選擇了15個sgRNA，一共8891個sgRNA靶向593個TF。除此之外我們還設(shè)計了100個靶向10個必須基因的sgRNA作為陰性對照。同時在sgRNA的3'和5'端添加與pGTPA的質(zhì)粒骨架同源的25個核苷酸序列，以促進sgRNA文庫的組裝（圖5）。

圖5

在芯片合成sgRNA文庫后，我們將sgRNA文庫組裝到pGTPA質(zhì)粒中。對質(zhì)粒的NGS分析顯示100%的spacer序列以低偏差存在于質(zhì)粒文庫中。將質(zhì)粒文庫電穿孔到含有pCASTPA的PAO1菌株中生成突變菌種文庫。在用蔗糖和慶大霉素篩選后，收集到大約2.6×106個菌落，達到了sgRNA質(zhì)粒文庫~290倍的覆蓋率，保證了文庫的完整性。

STAGE突變文庫的高通量測序分析

為了評估構(gòu)建的STAGE菌株庫的質(zhì)量，我們通過向每個插入片段引入唯一分子標(biāo)識符(UMI)來設(shè)計定量擴增子測序策略。在對NGS文庫進行深度測序后，計算UMI數(shù)以表示靶向插入事件的頻率（圖6）。

圖6

首先我們確定了每個插入位點與設(shè)計的spacer的最近識別位點之間的距離，大多數(shù)插入事件發(fā)生在識別位點下游的60-70個堿基對(bp)，與大腸桿菌中ShCAST系統(tǒng)的插入模式一致（圖7A）。此外，我們還觀察到5bp重復(fù)插入事件，這是Tn7轉(zhuǎn)座產(chǎn)物的標(biāo)志性特征。而在整個基因組中插入事件中，發(fā)現(xiàn)總reads的約93%位于目標(biāo)位點附近。對NGS數(shù)據(jù)的進一步分析顯示，92.9%的設(shè)計spacer序列下游存在插入事件，且覆蓋了98.48%的靶基因，未檢測到所有針對10個必需基因（陰性對照）的插入事件。大多數(shù)靶基因中均鑒定到了超過10個以上的sgRNA介導(dǎo)的插入事件，這些插入事件發(fā)生的頻率很高（圖7B）。值得注意的是，插入頻率在目標(biāo)靶基因之間差異很大（圖7C）。為了評估插入頻率是否反映了局部序列特征，我們計算了可能影響gRNA識別的多個因素，包括PAM序列、GC含量、相對于目標(biāo)基因的相對位置和基因組命中分數(shù)。然而，插入頻率與這些因素僅微弱相關(guān)。環(huán)境壓力和不同轉(zhuǎn)座子突變體的生長速度也可能會干擾插入頻率的鑒定。通過將sgRNA質(zhì)粒文庫的豐度與相應(yīng)靶基因的插入讀數(shù)進行比較，我們注意到靶基因內(nèi)部所有插入事件總體的插入讀數(shù)分布與原始質(zhì)粒豐度顯著不同，表明STAGE文庫的插入頻率在培養(yǎng)過程中受到了影響。我們進一步分析了插入頻率顯著變化的目標(biāo)基因，揭示了插入頻率降低或增加的兩個基因類別（圖7D）。這一結(jié)果表明，這些基因的破壞會嚴重影響細菌的生長，導(dǎo)致這些突變體的快速生長或死亡。

圖7

而在插入頻率低的基因中，除了10個必需基因的陰性對照組外，我們在STAGE菌株庫中還觀察到14個不可編輯基因。其中ptrB、mucA、rsmA和glnK四個基因被Tn-seq識別為必需基因。而之前的研究表明，這四個基因都能夠在銅綠假單胞菌中成功刪除，因此這些基因的重要性存疑。總之，這些結(jié)果表明，ShCAST介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座子篩選是一種強大而可靠的必需基因鑒定方法。

STAGE文庫抗生素耐藥相關(guān)基因的鑒定

銅綠假單胞菌是ICU、老年患者和燒創(chuàng)傷患者局部感染和全身感染的常見病原菌。近年來，銅綠假單胞菌的感染率呈現(xiàn)上升趨勢，同時耐藥性也日益嚴峻，因此迫切需要闡明耐藥機制并開發(fā)治療方法。我們試圖使用STAGE文庫確定導(dǎo)致銅綠假單胞菌抗生素耐藥性的基因和相關(guān)途徑。我們用三種不同的臨床相關(guān)抗生素(亞胺培南，頭孢他啶和氧氟沙星)處理STAGE突變文庫。暴露于亞致死水平的抗生素會導(dǎo)致細菌生長的分化，從而使耐藥突變體在培養(yǎng)過程中富集，而抗生素敏感突變體逐漸被消除（圖8）。

圖8

我們對所有樣品進行了NGS分析，在對照組和抗生素處理組之間沒有明顯的插入分布差異，這表明大多數(shù)TF突變體的相對生長沒有受到顯著影響抗生素治療（圖9A）。通過比較抗生素處理樣品中每個靶基因的插入讀數(shù)與未處理對照樣品的插入讀數(shù)，我們能夠識別出與抗生素抗性有關(guān)的基因。首先對亞胺培南處理樣品分析，確定ampG、mucB、ampC、ampR、hptB、dksA、rsmA和algU基因的破壞會增加細菌對亞胺培南的易感性，幾乎所有的靶向這八個基因的插入讀數(shù)同時下降，支持了在亞胺培南存在下這些基因的破壞確實會減少細菌生長的觀點（圖9B、9C）。類似地，在頭孢他啶處理后，靶向mexR、nalC和nalD基因的插入讀數(shù)上升，表明這些基因的破壞有助于頭孢他啶耐藥。相反，algU、ampDh2和dksA基因的破壞降低了細菌對頭孢他啶的耐藥性。此外，確定了mexR、mexZ、nfxB、nalC和nalD基因的突變可以提高細菌對氧氟沙星的耐藥性。在三個處理組中確定的基因中，我們注意到一些基因涉及兩個或更多的處理組，這表明可能存在某些多藥耐藥性的普遍機制（圖9D）。

圖9

突變體重建驗證已識別的抗性/敏感基因

為了驗證從STAGE文庫中鑒定出的基因在抗生素耐藥性中的作用，我們使用基于CRISPR-Cas9的基因組編輯技術(shù)重建了可靠的突變體。mucB、rsmA、hptB或dksA基因的失活顯著降低了細菌對亞胺培南的耐藥性。值得注意的是，當(dāng)在亞胺培南存在下使algU失活時，沒有觀察到突變菌株的生長。在頭孢他啶存在的情況下，mexR和nalD突變體的生長速度比野生型菌株快，而algU、dksA和ampDh2突變體的生長明顯受到抑制。此外，mexR、mexZ或nalD基因的破壞增加了細菌對氧氟沙星的耐藥性（圖10）。所有這些表型都可以通過重新引入野生型基因來恢復(fù)。此外，我們檢查了algU、mexZ和dksA基因在其他兩種銅綠假單胞菌菌株P(guān)AK和PA14中的抗生素抗性作用，其結(jié)果與PAO1菌株的結(jié)果一致。總之，這些發(fā)現(xiàn)表明STAGE方法是一種有效且可靠的工具，可用于基因型-表型關(guān)系的高通量分析。

圖10

在從STAGE文庫鑒定的基因中，ampG、ampC、ampR和mucB先前已通過全基因組轉(zhuǎn)座子篩選被鑒定為與亞胺培南抗性有關(guān)。MexR、NalC和NalD是MexAB-OprM多藥外排泵的阻遏物。這些基因的失活會上調(diào)MexAB-OprM泵的表達，從而增加細菌對頭孢他啶和氧氟沙星的耐藥性。MexZ和NfxB分別是MexXY-OprD和MexCD-OprJ外排泵的阻遏物。mexZ和nfxB基因的失活導(dǎo)致MexXY-OprD和MexCD-OprJ外排泵的過度表達，從而導(dǎo)致氧氟沙星抗性。algU基因是參與藻酸鹽生物合成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，它可以影響生物膜的形成，從而影響對抗菌劑的抗性，因此algU的突變導(dǎo)致菌株對亞胺培南和頭孢他啶敏感。rsmA、dksA、hptB和ampDh2基因在細菌對亞胺培南或頭孢他啶的耐藥性中的作用僅在本研究中發(fā)現(xiàn)，其調(diào)控機制尚不清楚（圖11）。

圖11

綜上所述，在這項研究中，我們報告了STAGE的方法，這是一種使用Cas12k引導(dǎo)的轉(zhuǎn)座酶在不同微生物物種中進行高通量位點特異性基因組工程的方法。除基因破壞外，STAGE還可用于將功能基因組元件高通量整合到不同微生物物種的目標(biāo)基因組位點中，這是以往依賴同源重組或隨機轉(zhuǎn)座子誘變的方法難以實現(xiàn)的。這種方法也可用于混合細菌群落中的多重基因破壞和物種特異性遺傳操作。轉(zhuǎn)座酶組件的未來工程和進化可以提高該系統(tǒng)的靶向特異性，并可能擴大其在真核細胞中的應(yīng)用。

上海科技大學(xué)副研究員陳未中和駱觀正實驗室博士生任澤慧為本論文共同第一作者，駱觀正實驗室博士生柴國師參與了工作，上海科技大學(xué)季泉江教授和中山大學(xué)駱觀正教授為共同通訊作者。本研究受到科技部重點研發(fā)計劃、國家自然科學(xué)基金、上海市自然科學(xué)基金和廣東省自然科學(xué)基金的支持。

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https://doi.org/10.1016/j.celrep.2021.109635

文 / 任澤慧

編 / 陳鴻萱

審 / Don

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生物信息與表觀組學(xué)

ID｜luolab2017

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總結(jié)

以上是生活随笔為你收集整理的Cell Reports：CRISPR-Cas12k引导的细菌普适性靶向遗传筛选系统的全部內(nèi)容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問題。

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