今天分享一篇2021年6月份的文章，發(fā)表在Hepatology, IF:17.423。文章探索了伴有血管侵犯肝細胞癌的分子景觀，識別了由MYC癌基因驅(qū)動的不同轉(zhuǎn)錄、表觀遺傳和蛋白質(zhì)組學變化；FN1蛋白組織高表達，血漿水平高表達及其侵襲遷移的生物學功能，并證實FN1作為潛在無創(chuàng)生物診斷標記物的臨床意義。文章內(nèi)容復雜，環(huán)環(huán)相扣，讓我們看看它是如何完成的。

一、摘要

Background and aims:?血管侵犯(VI)是HCC復發(fā)和預后不良的一個重要危險因素。HCC中血管侵犯的分子驅(qū)動因素還有待研究。探索侵襲性HCC的分子景觀將有助于識別治療靶點和無創(chuàng)性生物標志物。

Approach and results:?本研究，使用癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas; TCGA)數(shù)據(jù)。?在TCGA肝癌隊列（n = 373）中，5% (n = 17)的腫瘤存在大血管侵犯，25% (n = 94)的腫瘤存在微血管侵犯。?功能通路分析顯示，MYC癌基因是VI中mRNA、miRNA和蛋白質(zhì)組學變化的共同上游調(diào)控因子。研究進行了侵襲性的人源性HCC和MYC驅(qū)動的小鼠源性HCC的蛋白質(zhì)組學比較分析，確定了纖維連接蛋白是侵襲性HCC的蛋白質(zhì)組學生物標志物(小鼠纖維連接蛋白1 [Fn1]， P = 1.7 × 10-11;?人類FN1, P = 1.5 × 10-4)。?在機制上，研究發(fā)現(xiàn)FN1促進肝癌細胞的遷移和侵襲表型。通過一個獨立的人HCC組織芯片隊列證明了人HCC中纖維連接蛋白過表達(n = 153; P < 0.001)。?最后，相對于肝硬化患者，HCC患者血漿纖維連接蛋白水平顯著升高。????

Conclusions:研究探索了伴有血管侵犯肝細胞癌的分子景觀，識別了由MYC癌基因驅(qū)動的不同轉(zhuǎn)錄、表觀遺傳和蛋白質(zhì)組學變化。MYC上調(diào)纖維連接蛋白FN1的表達，促進了HCC的侵襲性。此外，纖維連接蛋白FN1是伴血管侵犯HCC中的一種有前途的無創(chuàng)蛋白生物標志物。

二、流程圖

三、結(jié)果簡述

1.?血管侵犯是與肝癌復發(fā)相關的預后因素。

在TCGA隊列(n=373)中，血管侵犯(VI)存在于34.9%的腫瘤患者(n=111)，大血管侵犯存在于5.8% 患者(n=17)和微血管侵犯存在于29.1% 患者(n=94)。

腫瘤分期越晚期(I期為14%，II期為64%，III期為53%)(p=0.03)，更高的腫瘤分級(15%的低分級，46%的中/高分級)(p=0.03)，更高的血清甲胎蛋白水平(p=0.02)，HCC患者伴血管侵犯的患病率越高。

微血管侵犯(64%)和大血管侵犯(65%)腫瘤的復發(fā)率高于無血管侵犯(45%)的腫瘤。

(p < 0.001）。

與沒有血管侵犯的HCC患者相比，存在大血管侵犯HCC患者預后較差。與無血管侵犯的HCC患者相比，存在微小或大血管侵犯的HCC患者無復發(fā)生存期明顯較短。總之，HCC中存在血管侵犯與侵襲性腫瘤行為和不良預后密切相關。

為了確定人類HCC中驅(qū)動血管侵犯的基因組事件，研究首先比較了有或沒有血管侵犯的腫瘤突變譜。TP53突變在血管侵犯腫瘤中的發(fā)生率(37.5%)高于無血管侵犯腫瘤的發(fā)生率(25%)。(p = 0.03)。與無血管侵犯的HCC患者相比，染色質(zhì)結(jié)構的調(diào)節(jié)因子HIST1H1C的突變幾乎只存在于血管侵犯的HCC患者中（4.8%vs0.5%,p=0.01）。

此外，在有無血管侵犯的HCC患者之間，沒有發(fā)現(xiàn)任何顯著的拷貝數(shù)差異，拷貝數(shù)變之間具有相似性。

因此，目前的研究結(jié)果并沒有揭示伴血管侵犯的HCC腫瘤中基因型與表型之間的關系，這促使進一步研究轉(zhuǎn)錄組學和蛋白質(zhì)組學的景觀。

2.?伴有血管侵犯的HCC轉(zhuǎn)錄組景觀。

研究進一步分析了HCC的轉(zhuǎn)錄譜，以識別血管侵犯腫瘤中失調(diào)的基因和通路。研究識別出102個差異表達基因，其中92個基因高表達，10個基因低表達。

將血管侵襲相關基因標記與已發(fā)表的HCC預后基因標記進行比較，研究發(fā)現(xiàn)在HCC中與不良預后相關的基因類富集，如Hoshida亞類S1，Boyault G3亞類和Woo肝癌復發(fā)特征等。

研究進行了上游調(diào)控途徑分析，以確定全局轉(zhuǎn)錄變化的基因組驅(qū)動因素。最終識別出MYC (p=9.8 x 10-4)， CREBZF (p=2.0 x 10-3)， HOXD13 (4.2 x . 4)，ATF4 (5.0 x 10-3)和ZBTB17 (5.02 x 10-3)是血管侵襲相關轉(zhuǎn)錄組中最重要的上游調(diào)控因子。通過證明血管侵襲相關基因標記與之前報道的其他幾個MYC基因標記顯著重疊，進一步證實MYC是這一表型的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。

對于microRNA而言, 研究鑒定了70個microRNA，這些microRNA在血管侵犯的腫瘤中有差異表達，其中23個過表達，47個低表達。前10差異表達的microRNA及對應的靶基因展示如下。

其中的一些microRNA，如mir-122、mir-21和mir-100，此前已被證實與HCC發(fā)病機制有關。這些數(shù)據(jù)證明了microRNAs如何可能使腫瘤轉(zhuǎn)向更具侵襲性的表型。研究進一步分析上游調(diào)控因子分析，發(fā)現(xiàn)TP53 (p=1.4 X 10-10)、MYC (3.4 X 10-5)、CDKN2A (p=1.7 X10-4)、NPM1 (p=1.3 X10-4)和YBX1 (p=9.7 X10-4)是差異表達的血管侵犯相關microRNAs的前五大轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。

本研究通過對血管侵犯HCC腫瘤轉(zhuǎn)錄譜的分析揭示了與侵襲表型相關的基因和通路的富集，并確定了MYC癌基因作為HCC中血管侵襲的共同驅(qū)動因素（從mRNA,microRNA轉(zhuǎn)錄水平分析）。

3.?伴有血管侵犯的HCC 蛋白質(zhì)組學改變的功能評估

考慮到蛋白質(zhì)是細胞功能的最終效應器，為了進一步理解基因組和轉(zhuǎn)錄組變化的功能含義，研究分析了血管侵犯HCC腫瘤的蛋白質(zhì)組學景觀。在有無血管侵犯的腫瘤中進行差異蛋白表達分析，共識別出87個差異表達蛋白。

血管侵犯HCC腫瘤中表達前10種蛋白參與了多種細胞功能，包括細胞黏附、凋亡和代謝等。

蛋白組學變化的功能通路分析揭示了細胞活力(p=6.4 × 10-39)、細胞遷移(p=4.1 × 10-31)、增殖(p=1.5 × 10-49)和血管生成等生物學過程(p=3.5x10-14)在血管侵犯HCC腫瘤中顯著上調(diào)，而凋亡(3.1x10-54)和衰老(7.7x10-15)等通路顯著下調(diào)。

研究評估了蛋白質(zhì)組變化的上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。前5位調(diào)控因子分別為TP53 (p= 1.4 × 10-37)、MYC (p=8.7 × 10-24)、JUN (p=5.3 × 10-23)、E2F1 (4.3 × 10-22)和FOXM1 (p=1.7x10-19)。

同時，RB1通路、VHL通路等腫瘤抑制通路在血管侵犯腫瘤中顯著下調(diào)。因此，對HCC中與血管侵犯相關的蛋白質(zhì)組學變化的功能分析描繪了侵襲性腫瘤表型的特征。

4.跨物種蛋白質(zhì)組學分析表明，纖維連接蛋白是侵襲性HCC的生物標志物

本研究表明MYC癌基因是HCC中血管侵襲相關mRNA、microRNA和蛋白質(zhì)組學變化的上游重要調(diào)控因子。利用MYC驅(qū)動的小鼠源性轉(zhuǎn)基因模型進一步探索血管侵犯HCC腫瘤特征。

研究進一步發(fā)現(xiàn)血管侵犯是小鼠MYC-HCC的一個高度普遍的特征 。

研究通過液相色譜-質(zhì)譜法(LCMS)評估了與MYC-HCC相關的蛋白質(zhì)組學變化景觀。與對照組小鼠肝臟相比，HCC腫瘤組織中含392個過表達蛋白，360個低表達蛋白。（此處為方便展示將此圖旋轉(zhuǎn)了90°）。

甲胎蛋白(AFP)， β-catenin，vimentin等分子在人類HCC中較高，但在MYC-HCC更高；氨甲酰磷酸合成酶1，酸性磷酸酶1和醛縮酶B等分子在人類HCC中較低，但在MYC-HCC中更低。

在MYC-HCC中，蛋白質(zhì)組學變化的上游最顯著的調(diào)控因子被證實為MYC (p=8.2 X 10-79)。人HCC中其他基因組調(diào)控因子如Trp53 (4.1 X 10-53)和β-catenin (4.2 X 10-23)也被發(fā)現(xiàn)是MYC-HCC蛋白組學變化的重要上游調(diào)控因子，如下圖所示。

在生物功能上，如癌細胞遷移(p=6.9 X 10-8)和侵襲性(1.4 X 10-7)在小鼠MYC-HCC中被激活，從而證實MYC-HCC腫瘤具有侵襲性表型。

研究進行跨物種比較分析，以識別在MYC驅(qū)動的小鼠HCC (n=759)和伴有血管侵犯的人HCC (n=87)富集的共有蛋白，最終發(fā)現(xiàn)7種蛋白質(zhì)在兩組之間重疊。

其中，纖維連接蛋白（FN1）在兩個隊列中都是過表達蛋白。蛋白印跡法(WB)進一步證實了纖維連接蛋白在MYC驅(qū)動的小鼠HCC中過表達。

免疫熒光表明在MYC-HCC的癌細胞和腫瘤間質(zhì)中，纖維連接蛋白都被觀察到過表達。此外，基質(zhì)FN1主要在血管周和瘤周部位表達，在MYC-HCC的IHC染色中，10%的癌細胞本身表達FN1。

研究發(fā)現(xiàn)FN1在MYC-HCC中過表達。隨后進一步發(fā)現(xiàn)MYC促進纖連蛋白FN1轉(zhuǎn)錄的機制證據(jù)。首先，Chip-seq實驗的meta分析顯示，MYC在該基因中與人類FN1基因上游結(jié)合。而后，motif 分析表明在真核啟動子數(shù)據(jù)庫(EPD)的數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)FN1啟動子區(qū)域有多個MYC結(jié)合位點。隨后，利用ENCODE數(shù)據(jù)庫，根據(jù)FN1轉(zhuǎn)錄起始位點附近MYC結(jié)合位點的存在，確定FN1為MYC的轉(zhuǎn)錄靶基因。最后，發(fā)現(xiàn)在TCGA泛癌數(shù)據(jù)庫中，包括HCC在內(nèi)的13個實體瘤中，MYC水平與FN1水平呈正相關。（這些圖均在附圖，由于權限附件未能下載）。綜上所述，這些結(jié)果表明MYC在癌細胞中轉(zhuǎn)錄調(diào)控FN1的表達。

5. 纖維連接蛋白(FN1)促進人肝細胞癌的侵襲和遷移

研究首先評估了纖維連接蛋白在人類HCC中的功能作用，利用cancer dependency map data數(shù)據(jù)庫分析全基因組CRISPRi和RNAi來評估敲除纖維連接蛋白FN1影響肝癌細胞系的生存能力情況。在20個HCC細胞系中，所有細胞系在CRISPRi或RNAi篩選上的依賴評分均不低，表明FN1對肝癌細胞的存活或增殖不是必需的。

為了評估FN1在HCC中的功能作用，使用FN1敲低的兩種HCC細胞株SKHep1和sn182F，這兩種細胞株都有中性依賴評分。分別用qPCR和免疫熒光證實FN1 mRNA和蛋白的敲除效果。

由于在人類HCC中發(fā)現(xiàn)FN1與血管侵襲有關，本研究采用基底膜侵襲試驗評估FN1是否在癌細胞侵襲中發(fā)揮作用。研究結(jié)果表明FN1敲低的癌細胞通過基底膜的侵襲能力下降。

通過劃痕實驗，研究還發(fā)現(xiàn)FN1敲低的SKHep1細胞系遷移能力也下降。上述結(jié)果均表明FN1促進肝癌細胞的侵襲和遷移能力。

6. 驗證人HCC中纖維連接蛋白組織表達

在TCGA隊列中，纖維連接蛋白FN1在腫瘤中的表達不僅與血管浸潤有相關性，而且FN1高表達與腫瘤分期晚(p=0.01)腫瘤分級高(p=0.08)，無瘤復發(fā)期短(p=0.001)（這些圖均在附圖，由于權限附件未能下載）。通過組織芯片進一步證實FN1的表達情況，肝細胞癌中FN1表達陽性的細胞百分比高于無肝細胞癌的肝硬化(25.3% vs. 17%， p=0.002)或?qū)φ战M非肝組織(25.3% vs. 8.9%， p=0.01)。

此外，研究還評估了來自公共肝癌樣本庫的人類病理蛋白圖譜(HCPA)數(shù)據(jù)庫的纖連蛋白表達情況，與組織芯片結(jié)果具有一致性，HCC腫瘤中均表達了纖維連接蛋白，大多數(shù)(75%，n=9)中至高表達，25%低表達。這些數(shù)據(jù)證實了纖維連接蛋白在人類HCC中顯著過表達。

為了驗證FN1表達與血管侵犯HCC之間的關系，研究分析了已知血管侵犯的腫瘤(n=6)和無血管浸潤的腫瘤(n=6)的FN1表達差異和獨立隊列中人類HCC組織(n=12)中FN1的表達。兩組患者的原發(fā)性腫瘤分期和肝硬化病因相匹配。結(jié)果仍表明FN1在肝癌組織中高表達。

此外，研究發(fā)現(xiàn)FN1在微血管侵犯腫瘤中的表達高于無微血管侵犯的腫瘤(p = 0.001)。有趣的是，在血管侵犯的腫瘤微血管系統(tǒng)中，纖維連接蛋白FN1在腫瘤栓子中持續(xù)過表達。這些結(jié)果表明在人類HCC中，腫瘤FN1表達與血管侵犯相關。

6. 纖維連接蛋白（FN1）作為晚期HCC的非侵襲性生物標志物

最后，該研究評估了纖維連接蛋白FN1是否可以作為肝癌的非侵襲性血漿生物標志物。研究進行了一項試點病例對照研究，前瞻性招募了年齡、性別、種族和肝硬化病因相匹配的HCC患者(n=35)和無HCC肝硬化患者(n=10)。

與肝硬化對照組相比，HCC患者血漿纖維連接蛋白水平顯著升高。相比之下，在TCGA隊列中，另外兩種在HCC組織中高表達的蛋白PAI-1和VEGFR2在HCC患者血漿中沒有升高。AFP是HCC的一個已知的生物標志物，但在肝硬化患者之間沒有顯著差異。

FN1診斷HCC的靈敏度和特異性優(yōu)于AFP。聯(lián)合AFP和FN1比單獨FN1 或單獨AFP 診斷HCC具有更佳的靈敏度及特異性。PAI-1和VEGFR2作為診斷指標效果不佳。

血漿FN1水平在多灶性HCC患者和晚期HCC患者更高。基于肝病的病因分組，血漿FN1水平?jīng)]有顯著差異。與組織纖連蛋白FN1表達一致的是，腫瘤侵犯血管的HCC患者血漿FN1水平高于未侵犯血管的HCC患者。

四、優(yōu)缺點

當前的研究僅強調(diào)了具有血管侵犯的HCC腫瘤的獨特分子特征，然而本研究進一步深入分析了這種臨床相關的、侵襲性的HCC亞型。具有良好的創(chuàng)新性，補充空白。最終該研究確定MYC癌基因是這種血管侵犯HCC表型的主要驅(qū)動因素，并提出纖維連接蛋白FN1是侵襲性HCC的一個有前景的無創(chuàng)診斷預測因子。具有極佳的臨床意義。總之，本文章深入探究了血管侵犯肝細胞癌的分子特征，識別了癌基因MYC的重要作用，揭示了FN1的分子表達及生物學機制，并證實FN1可作為潛在無創(chuàng)診斷分子標記物的臨床價值。

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總結(jié)

以上是生活随笔為你收集整理的看生物信息学如何聚焦特定表型，探索分子机制，促进临床转化的全部內(nèi)容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問題。

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