今天分享一篇2021年6月份的文章，發(fā)表在Hepatology, IF:17.423。文章探索了伴有血管侵犯肝細(xì)胞癌的分子景觀，識(shí)別了由MYC癌基因驅(qū)動(dòng)的不同轉(zhuǎn)錄、表觀遺傳和蛋白質(zhì)組學(xué)變化；FN1蛋白組織高表達(dá)，血漿水平高表達(dá)及其侵襲遷移的生物學(xué)功能，并證實(shí)FN1作為潛在無(wú)創(chuàng)生物診斷標(biāo)記物的臨床意義。文章內(nèi)容復(fù)雜，環(huán)環(huán)相扣，讓我們看看它是如何完成的。

一、摘要

Background and aims:?血管侵犯(VI)是HCC復(fù)發(fā)和預(yù)后不良的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素。HCC中血管侵犯的分子驅(qū)動(dòng)因素還有待研究。探索侵襲性HCC的分子景觀將有助于識(shí)別治療靶點(diǎn)和無(wú)創(chuàng)性生物標(biāo)志物。

Approach and results:?本研究，使用癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas; TCGA)數(shù)據(jù)。?在TCGA肝癌隊(duì)列（n = 373）中，5% (n = 17)的腫瘤存在大血管侵犯，25% (n = 94)的腫瘤存在微血管侵犯。?功能通路分析顯示，MYC癌基因是VI中mRNA、miRNA和蛋白質(zhì)組學(xué)變化的共同上游調(diào)控因子。研究進(jìn)行了侵襲性的人源性HCC和MYC驅(qū)動(dòng)的小鼠源性HCC的蛋白質(zhì)組學(xué)比較分析，確定了纖維連接蛋白是侵襲性HCC的蛋白質(zhì)組學(xué)生物標(biāo)志物(小鼠纖維連接蛋白1 [Fn1]， P = 1.7 × 10-11;?人類(lèi)FN1, P = 1.5 × 10-4)。?在機(jī)制上，研究發(fā)現(xiàn)FN1促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲表型。通過(guò)一個(gè)獨(dú)立的人HCC組織芯片隊(duì)列證明了人HCC中纖維連接蛋白過(guò)表達(dá)(n = 153; P < 0.001)。?最后，相對(duì)于肝硬化患者，HCC患者血漿纖維連接蛋白水平顯著升高。????

Conclusions:研究探索了伴有血管侵犯肝細(xì)胞癌的分子景觀，識(shí)別了由MYC癌基因驅(qū)動(dòng)的不同轉(zhuǎn)錄、表觀遺傳和蛋白質(zhì)組學(xué)變化。MYC上調(diào)纖維連接蛋白FN1的表達(dá)，促進(jìn)了HCC的侵襲性。此外，纖維連接蛋白FN1是伴血管侵犯HCC中的一種有前途的無(wú)創(chuàng)蛋白生物標(biāo)志物。

二、流程圖

三、結(jié)果簡(jiǎn)述

1.?血管侵犯是與肝癌復(fù)發(fā)相關(guān)的預(yù)后因素。

在TCGA隊(duì)列(n=373)中，血管侵犯(VI)存在于34.9%的腫瘤患者(n=111)，大血管侵犯存在于5.8% 患者(n=17)和微血管侵犯存在于29.1% 患者(n=94)。

腫瘤分期越晚期(I期為14%，II期為64%，III期為53%)(p=0.03)，更高的腫瘤分級(jí)(15%的低分級(jí)，46%的中/高分級(jí))(p=0.03)，更高的血清甲胎蛋白水平(p=0.02)，HCC患者伴血管侵犯的患病率越高。

微血管侵犯(64%)和大血管侵犯(65%)腫瘤的復(fù)發(fā)率高于無(wú)血管侵犯(45%)的腫瘤。

(p < 0.001）。

與沒(méi)有血管侵犯的HCC患者相比，存在大血管侵犯HCC患者預(yù)后較差。與無(wú)血管侵犯的HCC患者相比，存在微小或大血管侵犯的HCC患者無(wú)復(fù)發(fā)生存期明顯較短。總之，HCC中存在血管侵犯與侵襲性腫瘤行為和不良預(yù)后密切相關(guān)。

為了確定人類(lèi)HCC中驅(qū)動(dòng)血管侵犯的基因組事件，研究首先比較了有或沒(méi)有血管侵犯的腫瘤突變譜。TP53突變?cè)谘芮址改[瘤中的發(fā)生率(37.5%)高于無(wú)血管侵犯腫瘤的發(fā)生率(25%)。(p = 0.03)。與無(wú)血管侵犯的HCC患者相比，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)因子HIST1H1C的突變幾乎只存在于血管侵犯的HCC患者中（4.8%vs0.5%,p=0.01）。

此外，在有無(wú)血管侵犯的HCC患者之間，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何顯著的拷貝數(shù)差異，拷貝數(shù)變之間具有相似性。

因此，目前的研究結(jié)果并沒(méi)有揭示伴血管侵犯的HCC腫瘤中基因型與表型之間的關(guān)系，這促使進(jìn)一步研究轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的景觀。

2.?伴有血管侵犯的HCC轉(zhuǎn)錄組景觀。

研究進(jìn)一步分析了HCC的轉(zhuǎn)錄譜，以識(shí)別血管侵犯腫瘤中失調(diào)的基因和通路。研究識(shí)別出102個(gè)差異表達(dá)基因，其中92個(gè)基因高表達(dá)，10個(gè)基因低表達(dá)。

將血管侵襲相關(guān)基因標(biāo)記與已發(fā)表的HCC預(yù)后基因標(biāo)記進(jìn)行比較，研究發(fā)現(xiàn)在HCC中與不良預(yù)后相關(guān)的基因類(lèi)富集，如Hoshida亞類(lèi)S1，Boyault G3亞類(lèi)和Woo肝癌復(fù)發(fā)特征等。

研究進(jìn)行了上游調(diào)控途徑分析，以確定全局轉(zhuǎn)錄變化的基因組驅(qū)動(dòng)因素。最終識(shí)別出MYC (p=9.8 x 10-4)， CREBZF (p=2.0 x 10-3)， HOXD13 (4.2 x . 4)，ATF4 (5.0 x 10-3)和ZBTB17 (5.02 x 10-3)是血管侵襲相關(guān)轉(zhuǎn)錄組中最重要的上游調(diào)控因子。通過(guò)證明血管侵襲相關(guān)基因標(biāo)記與之前報(bào)道的其他幾個(gè)MYC基因標(biāo)記顯著重疊，進(jìn)一步證實(shí)MYC是這一表型的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。

對(duì)于microRNA而言, 研究鑒定了70個(gè)microRNA，這些microRNA在血管侵犯的腫瘤中有差異表達(dá)，其中23個(gè)過(guò)表達(dá)，47個(gè)低表達(dá)。前10差異表達(dá)的microRNA及對(duì)應(yīng)的靶基因展示如下。

其中的一些microRNA，如mir-122、mir-21和mir-100，此前已被證實(shí)與HCC發(fā)病機(jī)制有關(guān)。這些數(shù)據(jù)證明了microRNAs如何可能使腫瘤轉(zhuǎn)向更具侵襲性的表型。研究進(jìn)一步分析上游調(diào)控因子分析，發(fā)現(xiàn)TP53 (p=1.4 X 10-10)、MYC (3.4 X 10-5)、CDKN2A (p=1.7 X10-4)、NPM1 (p=1.3 X10-4)和YBX1 (p=9.7 X10-4)是差異表達(dá)的血管侵犯相關(guān)microRNAs的前五大轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。

本研究通過(guò)對(duì)血管侵犯HCC腫瘤轉(zhuǎn)錄譜的分析揭示了與侵襲表型相關(guān)的基因和通路的富集，并確定了MYC癌基因作為HCC中血管侵襲的共同驅(qū)動(dòng)因素（從mRNA,microRNA轉(zhuǎn)錄水平分析）。

3.?伴有血管侵犯的HCC 蛋白質(zhì)組學(xué)改變的功能評(píng)估

考慮到蛋白質(zhì)是細(xì)胞功能的最終效應(yīng)器，為了進(jìn)一步理解基因組和轉(zhuǎn)錄組變化的功能含義，研究分析了血管侵犯HCC腫瘤的蛋白質(zhì)組學(xué)景觀。在有無(wú)血管侵犯的腫瘤中進(jìn)行差異蛋白表達(dá)分析，共識(shí)別出87個(gè)差異表達(dá)蛋白。

血管侵犯HCC腫瘤中表達(dá)前10種蛋白參與了多種細(xì)胞功能，包括細(xì)胞黏附、凋亡和代謝等。

蛋白組學(xué)變化的功能通路分析揭示了細(xì)胞活力(p=6.4 × 10-39)、細(xì)胞遷移(p=4.1 × 10-31)、增殖(p=1.5 × 10-49)和血管生成等生物學(xué)過(guò)程(p=3.5x10-14)在血管侵犯HCC腫瘤中顯著上調(diào)，而凋亡(3.1x10-54)和衰老(7.7x10-15)等通路顯著下調(diào)。

研究評(píng)估了蛋白質(zhì)組變化的上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。前5位調(diào)控因子分別為T(mén)P53 (p= 1.4 × 10-37)、MYC (p=8.7 × 10-24)、JUN (p=5.3 × 10-23)、E2F1 (4.3 × 10-22)和FOXM1 (p=1.7x10-19)。

同時(shí)，RB1通路、VHL通路等腫瘤抑制通路在血管侵犯腫瘤中顯著下調(diào)。因此，對(duì)HCC中與血管侵犯相關(guān)的蛋白質(zhì)組學(xué)變化的功能分析描繪了侵襲性腫瘤表型的特征。

4.跨物種蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明，纖維連接蛋白是侵襲性HCC的生物標(biāo)志物

本研究表明MYC癌基因是HCC中血管侵襲相關(guān)mRNA、microRNA和蛋白質(zhì)組學(xué)變化的上游重要調(diào)控因子。利用MYC驅(qū)動(dòng)的小鼠源性轉(zhuǎn)基因模型進(jìn)一步探索血管侵犯HCC腫瘤特征。

研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)血管侵犯是小鼠MYC-HCC的一個(gè)高度普遍的特征 。

研究通過(guò)液相色譜-質(zhì)譜法(LCMS)評(píng)估了與MYC-HCC相關(guān)的蛋白質(zhì)組學(xué)變化景觀。與對(duì)照組小鼠肝臟相比，HCC腫瘤組織中含392個(gè)過(guò)表達(dá)蛋白，360個(gè)低表達(dá)蛋白。（此處為方便展示將此圖旋轉(zhuǎn)了90°）。

甲胎蛋白(AFP)， β-catenin，vimentin等分子在人類(lèi)HCC中較高，但在MYC-HCC更高；氨甲酰磷酸合成酶1，酸性磷酸酶1和醛縮酶B等分子在人類(lèi)HCC中較低，但在MYC-HCC中更低。

在MYC-HCC中，蛋白質(zhì)組學(xué)變化的上游最顯著的調(diào)控因子被證實(shí)為MYC (p=8.2 X 10-79)。人HCC中其他基因組調(diào)控因子如Trp53 (4.1 X 10-53)和β-catenin (4.2 X 10-23)也被發(fā)現(xiàn)是MYC-HCC蛋白組學(xué)變化的重要上游調(diào)控因子，如下圖所示。

在生物功能上，如癌細(xì)胞遷移(p=6.9 X 10-8)和侵襲性(1.4 X 10-7)在小鼠MYC-HCC中被激活，從而證實(shí)MYC-HCC腫瘤具有侵襲性表型。

研究進(jìn)行跨物種比較分析，以識(shí)別在MYC驅(qū)動(dòng)的小鼠HCC (n=759)和伴有血管侵犯的人HCC (n=87)富集的共有蛋白，最終發(fā)現(xiàn)7種蛋白質(zhì)在兩組之間重疊。

其中，纖維連接蛋白（FN1）在兩個(gè)隊(duì)列中都是過(guò)表達(dá)蛋白。蛋白印跡法(WB)進(jìn)一步證實(shí)了纖維連接蛋白在MYC驅(qū)動(dòng)的小鼠HCC中過(guò)表達(dá)。

免疫熒光表明在MYC-HCC的癌細(xì)胞和腫瘤間質(zhì)中，纖維連接蛋白都被觀察到過(guò)表達(dá)。此外，基質(zhì)FN1主要在血管周和瘤周部位表達(dá)，在MYC-HCC的IHC染色中，10%的癌細(xì)胞本身表達(dá)FN1。

研究發(fā)現(xiàn)FN1在MYC-HCC中過(guò)表達(dá)。隨后進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)MYC促進(jìn)纖連蛋白FN1轉(zhuǎn)錄的機(jī)制證據(jù)。首先，Chip-seq實(shí)驗(yàn)的meta分析顯示，MYC在該基因中與人類(lèi)FN1基因上游結(jié)合。而后，motif 分析表明在真核啟動(dòng)子數(shù)據(jù)庫(kù)(EPD)的數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)FN1啟動(dòng)子區(qū)域有多個(gè)MYC結(jié)合位點(diǎn)。隨后，利用ENCODE數(shù)據(jù)庫(kù)，根據(jù)FN1轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近MYC結(jié)合位點(diǎn)的存在，確定FN1為MYC的轉(zhuǎn)錄靶基因。最后，發(fā)現(xiàn)在TCGA泛癌數(shù)據(jù)庫(kù)中，包括HCC在內(nèi)的13個(gè)實(shí)體瘤中，MYC水平與FN1水平呈正相關(guān)。（這些圖均在附圖，由于權(quán)限附件未能下載）。綜上所述，這些結(jié)果表明MYC在癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄調(diào)控FN1的表達(dá)。

5. 纖維連接蛋白(FN1)促進(jìn)人肝細(xì)胞癌的侵襲和遷移

研究首先評(píng)估了纖維連接蛋白在人類(lèi)HCC中的功能作用，利用cancer dependency map data數(shù)據(jù)庫(kù)分析全基因組CRISPRi和RNAi來(lái)評(píng)估敲除纖維連接蛋白FN1影響肝癌細(xì)胞系的生存能力情況。在20個(gè)HCC細(xì)胞系中，所有細(xì)胞系在CRISPRi或RNAi篩選上的依賴(lài)評(píng)分均不低，表明FN1對(duì)肝癌細(xì)胞的存活或增殖不是必需的。

為了評(píng)估FN1在HCC中的功能作用，使用FN1敲低的兩種HCC細(xì)胞株SKHep1和sn182F，這兩種細(xì)胞株都有中性依賴(lài)評(píng)分。分別用qPCR和免疫熒光證實(shí)FN1 mRNA和蛋白的敲除效果。

由于在人類(lèi)HCC中發(fā)現(xiàn)FN1與血管侵襲有關(guān)，本研究采用基底膜侵襲試驗(yàn)評(píng)估FN1是否在癌細(xì)胞侵襲中發(fā)揮作用。研究結(jié)果表明FN1敲低的癌細(xì)胞通過(guò)基底膜的侵襲能力下降。

通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)，研究還發(fā)現(xiàn)FN1敲低的SKHep1細(xì)胞系遷移能力也下降。上述結(jié)果均表明FN1促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。

6. 驗(yàn)證人HCC中纖維連接蛋白組織表達(dá)

在TCGA隊(duì)列中，纖維連接蛋白FN1在腫瘤中的表達(dá)不僅與血管浸潤(rùn)有相關(guān)性，而且FN1高表達(dá)與腫瘤分期晚(p=0.01)腫瘤分級(jí)高(p=0.08)，無(wú)瘤復(fù)發(fā)期短(p=0.001)（這些圖均在附圖，由于權(quán)限附件未能下載）。通過(guò)組織芯片進(jìn)一步證實(shí)FN1的表達(dá)情況，肝細(xì)胞癌中FN1表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞百分比高于無(wú)肝細(xì)胞癌的肝硬化(25.3% vs. 17%， p=0.002)或?qū)φ战M非肝組織(25.3% vs. 8.9%， p=0.01)。

此外，研究還評(píng)估了來(lái)自公共肝癌樣本庫(kù)的人類(lèi)病理蛋白圖譜(HCPA)數(shù)據(jù)庫(kù)的纖連蛋白表達(dá)情況，與組織芯片結(jié)果具有一致性，HCC腫瘤中均表達(dá)了纖維連接蛋白，大多數(shù)(75%，n=9)中至高表達(dá)，25%低表達(dá)。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了纖維連接蛋白在人類(lèi)HCC中顯著過(guò)表達(dá)。

為了驗(yàn)證FN1表達(dá)與血管侵犯HCC之間的關(guān)系，研究分析了已知血管侵犯的腫瘤(n=6)和無(wú)血管浸潤(rùn)的腫瘤(n=6)的FN1表達(dá)差異和獨(dú)立隊(duì)列中人類(lèi)HCC組織(n=12)中FN1的表達(dá)。兩組患者的原發(fā)性腫瘤分期和肝硬化病因相匹配。結(jié)果仍表明FN1在肝癌組織中高表達(dá)。

此外，研究發(fā)現(xiàn)FN1在微血管侵犯腫瘤中的表達(dá)高于無(wú)微血管侵犯的腫瘤(p = 0.001)。有趣的是，在血管侵犯的腫瘤微血管系統(tǒng)中，纖維連接蛋白FN1在腫瘤栓子中持續(xù)過(guò)表達(dá)。這些結(jié)果表明在人類(lèi)HCC中，腫瘤FN1表達(dá)與血管侵犯相關(guān)。

6. 纖維連接蛋白（FN1）作為晚期HCC的非侵襲性生物標(biāo)志物

最后，該研究評(píng)估了纖維連接蛋白FN1是否可以作為肝癌的非侵襲性血漿生物標(biāo)志物。研究進(jìn)行了一項(xiàng)試點(diǎn)病例對(duì)照研究，前瞻性招募了年齡、性別、種族和肝硬化病因相匹配的HCC患者(n=35)和無(wú)HCC肝硬化患者(n=10)。

與肝硬化對(duì)照組相比，HCC患者血漿纖維連接蛋白水平顯著升高。相比之下，在TCGA隊(duì)列中，另外兩種在HCC組織中高表達(dá)的蛋白PAI-1和VEGFR2在HCC患者血漿中沒(méi)有升高。AFP是HCC的一個(gè)已知的生物標(biāo)志物，但在肝硬化患者之間沒(méi)有顯著差異。

FN1診斷HCC的靈敏度和特異性?xún)?yōu)于AFP。聯(lián)合AFP和FN1比單獨(dú)FN1 或單獨(dú)AFP 診斷HCC具有更佳的靈敏度及特異性。PAI-1和VEGFR2作為診斷指標(biāo)效果不佳。

血漿FN1水平在多灶性HCC患者和晚期HCC患者更高。基于肝病的病因分組，血漿FN1水平?jīng)]有顯著差異。與組織纖連蛋白FN1表達(dá)一致的是，腫瘤侵犯血管的HCC患者血漿FN1水平高于未侵犯血管的HCC患者。

四、優(yōu)缺點(diǎn)

當(dāng)前的研究?jī)H強(qiáng)調(diào)了具有血管侵犯的HCC腫瘤的獨(dú)特分子特征，然而本研究進(jìn)一步深入分析了這種臨床相關(guān)的、侵襲性的HCC亞型。具有良好的創(chuàng)新性，補(bǔ)充空白。最終該研究確定MYC癌基因是這種血管侵犯HCC表型的主要驅(qū)動(dòng)因素，并提出纖維連接蛋白FN1是侵襲性HCC的一個(gè)有前景的無(wú)創(chuàng)診斷預(yù)測(cè)因子。具有極佳的臨床意義。總之，本文章深入探究了血管侵犯肝細(xì)胞癌的分子特征，識(shí)別了癌基因MYC的重要作用，揭示了FN1的分子表達(dá)及生物學(xué)機(jī)制，并證實(shí)FN1可作為潛在無(wú)創(chuàng)診斷分子標(biāo)記物的臨床價(jià)值。

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總結(jié)

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