單細胞測序?qū)嶒灧椒?/h2>

開發(fā)scRNA-seq的新實驗方法和操作手冊是目前很火的研究領(lǐng)域，而且最近這些年已經(jīng)發(fā)表了一些改進方法。上圖可以看出檢測的細胞數(shù)目以指數(shù)形式增加，以下是一份不完全的列表：

• STRT-seq

• Smart-seq

• CEL-seq

• MARS-seq

• SCRB-seq

• Smart-seq2

• Drop-seq

• InDrop-seq

• CEL-seq2

• Seq-well

• SMARTer

• Microwell-seq 【2018，郭國冀團隊】

總體流程如下圖所示：

這些方法可以用不同的方式分類，但兩個最主要的優(yōu)化是：定量和捕獲。

定量有兩種類型—-全長型和標簽型 (tag-based)。全長型力圖捕獲并均勻測序整條轉(zhuǎn)錄本，標簽型只捕獲轉(zhuǎn)錄本的5'或3'端。不同定量方式需要自己對應(yīng)的計算分析方法。全長方案理論上可以對整個轉(zhuǎn)錄本進行均勻測序，但實際上總會有測序覆蓋偏好性的存在。標簽型的主要優(yōu)點是可以與唯一的分子標識符(UMIs)結(jié)合進行更精確定量 (后面詳細描述)。其缺點是，測序限制在轉(zhuǎn)錄本的5'或3'端，可能會降低比對率，并且難以區(qū)分不同剪接體的表達。

捕獲的策略決定了實驗通量、細胞如何被選擇和除測序外的哪些額外信息可獲得。最常用的三種捕獲方式是基于微孔- (microwell-)，微流- (microfluidic-)，液滴- (droplet-)，細分如下圖所示。

對于基于微孔的捕獲平臺，先用移液管或者激光切割的方式分離細胞并放到微流孔中。它的一個優(yōu)點是可以結(jié)合流式細胞熒光分選（FACS, fluorescent activated cell sorting）根據(jù)表面Marker分選細胞。因此特別適合分選細胞子集用于測序。另一個優(yōu)點是可以獲得細胞形態(tài)全覽圖，提供多一個維度的信息，可用于鑒定微孔中是否有損傷的細胞或雙份細胞，主要缺點是通量低且每個細胞所需的工作量相當大。

微流型平臺，比如Fluidigm’s C1，提供了一個更加整合的系統(tǒng)，同時可以捕獲細胞和完成文庫構(gòu)建的準備過程。因此它們比微孔型平臺通量更高。但是微流型平臺大約只能捕獲10%的細胞，不適合處理稀有細胞或者細胞量很少的情況。此外，微流控芯片相對昂貴，不過更小的反應(yīng)體積可以節(jié)省試劑的費用。

液滴型方法是將單獨的細胞和一個包含建庫所學酶的珠粒 (bead)包裹在一個納米級液滴里面。特殊地，每個珠粒(bead)包含一段獨特的條形碼序列 (barcode)，會加到所有來自于液滴里面這個細胞的序列上，用于區(qū)分不同細胞的轉(zhuǎn)錄本。因此所有的液滴可以混合在一起測序，然后再根據(jù)barcode序列確定其是否歸屬于同一細胞。液滴型平臺通常有最高的通量，因為文庫的準備成本很低，約為0.05美元/每個細胞。隨之而來的，測序成本往往是其限制因素，通常測序深度比較低，只檢測幾千個轉(zhuǎn)錄本的表達。

Microwell-seq是浙江大學郭國冀老師研究組綜合以上技術(shù)的優(yōu)勢開發(fā)出的新的大規(guī)模低成本單細胞捕獲測序技術(shù)，單個細胞制備成本可以到0.02美元。

采用光刻技術(shù)制作微孔矩陣硅片（微孔直徑28 um，深度35 um，100,000個微孔），以此為模具制作PDMS微柱模具。這兩個模具可以反復(fù)使用。最終用于富集的微孔板是通過傾到5%的瓊脂糖凝膠到PDMS微柱模具上生成的。細胞懸液加到凝膠微孔模具上，利用重力使細胞落入微孔，通常一個微孔只能容納一個細胞，一塊板子可以同時捕獲約10000個單細胞。每一步操作都可視、可控制，doublets可以通過鏡檢洗除。隨后每個空加入包含10^7-108特定探針集的與孔徑大小匹配的磁珠，標記每個細胞中的mRNA（每個磁珠的寡核苷酸序列中都有一段特異的序列用于標記細胞來源），然后使用Smart-seq2方法進行后續(xù)的反轉(zhuǎn)錄、擴增。擴增后的cDNA片段使用轉(zhuǎn)座酶片段化(這步倒有些類似ATAC-seq)，富集3’末端轉(zhuǎn)錄本序列測序。

如何選擇合適的平臺？

平臺選擇取決于手上的生物問題，舉個例子，如果一個人對描述組織的細胞類型構(gòu)成感興趣，能夠捕獲大量細胞的液滴型平臺很可能是最合適的，而如果感興趣的是有已知的表面Marker的稀有細胞群體，那最好用流式細胞FACS分選法富集細胞并對少量細胞進行測序。

如果對研究不同剪接體的表達感興趣，全長轉(zhuǎn)錄本定量會更適合。相反，UMIs只適用于tagged protocol，更有利于穩(wěn)定定量基因水平的表達。

Enard團隊和Teichmann團隊的最近兩項研究對幾種不同單細胞分選和建庫方案進行了比較，Ziegenhain等用同一種老鼠胚胎干細胞 (mESCs)比較了五種不同方案。通過控制細胞數(shù)量和測序深度，作者能直接比較不同方法檢測敏感性，噪音水平和費用差異。他們的一個結(jié)論如下圖，不同方法檢測到的基因數(shù)量 (檢測閾值固定)差別挺大。如圖所示，drop-seq檢測到的基因數(shù)目最少，和Smart-seq2檢測到的基因數(shù)差了近乎兩倍，意味著不同方案的選擇對研究影響很大。

Svensson等人則采用了一種不同的方法，即通過使用已知濃度的合成轉(zhuǎn)錄本 (spike-ins, 后面詳細介紹)來評估不同方案的準確性和敏感性。通過廣泛比較同樣發(fā)現(xiàn)不同的細胞分離建庫方式差別較大。Bulk測序的準確性和敏感性相對最好，其它方法準確性高的，敏感性就會差一些。

隨著實驗操作技術(shù)的發(fā)展和計算方法的改進，后續(xù)研究可以幫助我們進一步了解不同方法的適用優(yōu)缺點。這些比較研究不僅有助于研究人員決定使用哪種方案，而且可以通過基準測試確定哪個方法組合最有效來研發(fā)新的單細胞實驗和計算方法。

總結(jié)

以上是生活随笔為你收集整理的Hemberg-lab单细胞转录组数据分析（二）的全部內(nèi)容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問題。

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