在我們做單細胞分離過程中，導師千叮嚀萬囑咐說樣品不能凍存，而我在一次會議論壇上有一位學者直接說凍存基本沒有影響，于是，我。。。。。。母雞。

2019年12月31日（真是抓住了2019的小尾巴！），英國Wellcome Sanger Institute研究團隊于Genome Biology發表了題為scRNA-seq assessment of the human lung, spleen, and esophagus tissue stability after cold preservation的研究內容，探究樣品凍存和凍存時間對人體肺臟、脾臟和食管組織單細胞轉錄組測序的影響。

研究背景：

為了解決在組織解離或儲存時引起的快速轉錄變化/應激反應，已經開發了一系列細胞冷凍或固定方法。Guillaumet-Adkins等證明，培養細胞或切碎的小鼠活檢組織在DMSO冷凍保存后盡管活力降低，但轉錄譜并沒有發生明顯改變。但是，某些類型的細胞比其他類型的細胞在冷凍時更容易收到傷害，例如，在人子宮內膜活檢中，基質細胞比上皮細胞在冷凍條件下存活率更高。另外，有研究評估了用傳統的交聯固定劑，可逆交聯劑，非交聯替代品（例如甲醇）和其他新型穩定劑固定細胞的能力。固定雖然通常會產生3’偏倚，但可以阻止轉錄變化并保證細胞類型不發生變化。迄今為止，只在解離的細胞或至多切碎的組織上測試了這些試劑，而在完整的組織樣品上尚未進行測試。不幸的是，在運輸之前對人類臨床樣品先進行解離通常是不實際的，并且使用傳統的機械或酶解方法來解離固定的組織塊通常是比較難的。

在這項研究中，作者旨在確定一種組織保存方法，可以在最少的臨床處理和一定的運輸時間內保證用于scRNA-seq的完整組織樣本的轉錄狀態保持穩定。為了有助于人類細胞圖譜項目，作者在對缺血具有不同敏感性的三種人類原發組織上測試了該方法：脾臟（最穩定），食道粘膜和肺部（最不穩定）。這些組織包含從免疫細胞到角質形成細胞等多種不同細胞類型。從死去的器官捐獻者身上采集樣本，并在捐獻者死亡后迅速用冷器官保存液進行灌注。

該研究產生的24萬個單細胞數據集包括迄今為止人類食道和脾臟最大的公開的單細胞數據集。數據可以在www.tissuestabilitycelllas.org瀏覽分析。研究發現，將這3個器官的完整組織塊保存在4攝氏度的HypoThermosol FRS中24h或72h（大部分樣品是保存72h），再進行普通和10x 3’富集單細胞轉錄組測序，轉錄圖譜幾乎沒有影響。scRNA-seq得到的群體多樣性結果未隨冷凍時間變長而發生變化。該方案應該很容易被許多臨床機構采用，并允許至少24小時的時間窗口以便將樣本運送給合作者，因此增加了獲得新鮮人體組織進行研究的機會。

研究內容：

1. 冷藏后scRNA-seq數據質量良好

作者從12個器官供體獲得了肺、食道和脾臟樣本，并利用全基因組測序和病理學切片評估，樣品都為健康樣品，以免樣品中存在一些腺體或炎癥影響到scRNA-seq結果的評估。將新鮮樣品立即解離（T0）或在4°C下保存12h、24h和72h的冷缺血時間再解離，然后通過10X 3’ v2 scRNA-seq進行單細胞測序。如下圖所示，在對scRNA-seq數據進行比對和標準化后，評估所有樣品的質量控制指標。對于肺和食道，每個樣本的reads數、每個樣本的細胞數、每個細胞檢測到基因數目的中位數以及其他質量指標并未隨時間顯著變化，但是脾臟器官冷藏保存72小時的樣品的reads比對率降低明顯。

結論：作者沒有檢測到在冷缺血時間的24小時內與冷藏時間長度有關的質控指標變化。（【冷缺血時間】：器官從冷灌注（冷保存）開始到移植后供血開始的這段時間。）

圖1

2. 冷存72h脾臟樣品中scRNA-seq數據質量降低

進一步細化分析發現僅在脾臟中觀察到外顯子reads數百分比顯著下降（圖2a，b）。此外，僅脾臟樣品中內含子的reads百分比隨儲存時間的增加而增加（圖2c，d）。脾臟在72h時高質量reads的比例變化（圖2b，c）可能會導致細胞類型特異性差異，這將在后面結果進一步探討。這一比對到內含子和外顯子的reads的比例變化在top 25%高質量外顯子reads和top 75%高質量內含子reads中變化更明顯，該結果暗示非剪接的reads對于降解更穩定 (這個結論得出的有些奇怪，有熟悉的朋友還請指導下)。最后研究人員也發現線粒體基因表達百分比僅在脾臟中隨時間顯著增加（圖2e,f,g）。

圖2(R語言學習 - 箱線圖（小提琴圖、抖動圖、區域散點圖）)

3. 時間對doublet rates和empty droplets的影響

首先是三個組織中液滴的Doublet得分均不隨時間變化。

接下來，作者評估了non-cellular droplets的變化。所有基于液滴的測序反應均產生許多不包含細胞但捕獲環境中的mRNA的液滴，通常稱為ambient RNA或?soup。針對每個液滴的測序深度標準化后的UMI數設置了一個相對隨意的閾值，將ambient RNA定義為0-0.25，debris定義為0.25-5，cellular materia定義為> 5 normalized UMI per droplet來反映reads的分布（圖3a）。脾、肺或食道樣品中冷存時間對含UMI的液滴比例無明顯影響。脾臟中debris類型的液滴中的normalized UMI的平均數于72h增加而cellular droplets卻減少（圖3b，c），肺或食道樣品中未觀察到此現象。但3個器官的debris?和cellular material的液滴平均normalized UMI都變化較大。

圖3

4. 細胞類型注釋

在肺中，57,020個細胞通過了質量控制并注釋為25種細胞類型。從血液和淋巴管中檢測到纖毛、肺泡1型和2型細胞、成纖維細胞、肌肉和內皮細胞。從免疫區室鑒定出的細胞類型包括NK、T和B細胞、兩種巨噬細胞、單核細胞和樹突狀細胞（DC）。檢測到多個DC細胞亞群，例如cDC1，漿細胞樣DC（pcDC）和激活的DC，分別占所有細胞的0.3％（163個細胞），0.08％（46個細胞）和0.2％（122個細胞）。在少數細胞中檢測到肺泡club細胞標記基因，但聚類算法未將這些細胞單獨聚類 (這個分類的分辨率也是很高的，46個細胞的類群都可以分出來，可能是初始分辨率設置的高，也可能是做了細胞簇細分。**分簇雖然比較直觀，也需要反復嘗試。盡可能分出更多有意義的簇，也要保住分簇結果的穩定性。)。

食道樣品質控后剩余87,947個細胞，其中90％以上屬于四種主要上皮細胞類型：upper,?stratified,?suprabasal, 和?dividing cells of the suprabasal layer。來自上皮基底層的其他細胞更緊密地聚集于腺管和粘液分泌細胞。食道中的免疫細胞包括T細胞、B細胞、單核細胞、巨噬細胞、DC和肥大細胞。有趣的是，幾乎80％的肥大細胞（87個細胞）來自單個供體。在該供體中還發現其他免疫細胞（B細胞，DC，單核細胞/巨噬細胞）的比例增加。這個供體診斷有呼吸機相關性肺炎，后期比較中已排除。

來自脾臟的所有94,257個細胞均標注為免疫細胞。卵泡B區和mantle zone B區細胞被認為是最大的細胞組群，分別占17％（> 16,000個細胞）和20％（> 18,000個細胞）。檢測到超過6000個漿細胞并標注為漿母細胞，且漿細胞表達IgG或IgM。超過28,000個T細胞被標注為CD4 +經典、CD8 +活化、CD + 4 naive、CD4 +卵泡輔助細胞（fh）、CD8 + MAIT樣、CD8 +γ-δ、CD8 +細胞毒性淋巴細胞（CTL）、CD4 +調節性或分裂T細胞。還確定了自然殺傷（NK）細胞的兩個亞群、一個分裂期的NK亞群、單核細胞、巨噬細胞和DC。多個細胞群的比例非常低，例如DC亞群，包括激活的DC（0.04％）、常規DC1（0.3％）和pcDC-s（0.3％），以及先天性淋巴樣細胞（0.6％）、CD34 +祖細胞（0.2％）、血小板（0.08％）和位于T和B細胞簇之間的未知細胞群（0.1％）。包含2207個以上同時表達T細胞和B細胞標記的細胞亞群可以代表相互作用細胞的doublet，稱為T_B doublet。

圖4

5. 特定細胞類型的變化。

注釋了細胞類型后，可以研究細胞類型組成比例隨冷存時間的變化。樣品之間和供體之間的細胞類型比例差異很大。當檢查供體中細胞類型隨時間的變化時，我們注意到脾臟（圖4f）中B細胞的比例隨存儲時間增加（關注圖中橘色系柱子區域），而肺（圖4d）和脾臟(圖4f)中T細胞（關注圖中藍色系柱子區域）的比例則隨存儲時間減少（圖4d-f， d lung, e esophagus, and f spleen）?（**生信寶典注：d,e,f子圖與a,b,c是分別垂直對應的，但各自圖上加一個標題標記器官名稱會更易于圖的解讀）。

接下來，作者檢查了存儲時間對轉錄組是否有細胞類型特異性的影響。值得注意的是，根據高度可變的基因計算出的UMAP圖并沒有隨時間明顯變化（圖4g，h）。整合所有組織的基因表達矩陣，并計算了由不同變量解釋的變異性百分比。如圖4j顯示，不同的供體、組織、細胞類型和細胞UMI總數解釋了最高比例的方差來源，而存儲時間的影響最小（紫色線）。（如果你也想做這個分析，見文章如何火眼金睛鑒定那些單細胞轉錄組中的混雜因素）

結論

作者提出了一種用于冷藏人體原始組織樣品的方法，該方法不需要在臨床現場進行除樣品采集以外的任何處理，并且給運輸、組織解離和scRNA-seq測序的至少24小時的操作時間。肺和食道樣本所有質量指標在冷藏72h內保持穩定。在脾臟中，我們觀察到72h時內含子和外顯子reads比例的變化以及線粒體reads百分比的增加。

結果表明組織樣品收集后立即放入冷組織保存溶液可以保證各種不同細胞類型在缺血后受影響最小。冷存時間對scRNA-seq數據中的細胞群體多樣性或24h內bulk RNA-seq的變化不存在影響。

另外作者提供了肺、脾臟和食道的數據資源，涵蓋單細胞、普通轉錄組、全基因組測序和臨床數據等，供領域科學家進一步分析使用。

這么大的數據量只發了一篇Genome biology，是不是有些大材小用了，那么這個數據資源是否還可以再深挖呢？

| 作者：張虎

| 校對：生信寶典

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總結

以上是生活随笔為你收集整理的冻存样品对单细胞测序影响大吗？的全部內容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問題。

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