轉(zhuǎn)錄組分析的正確姿勢(shì)（第三版）前言

NGS系列文章包括NGS基礎(chǔ)、轉(zhuǎn)錄組分析?（Nature重磅綜述|關(guān)于RNA-seq你想知道的全在這）、ChIP-seq分析?（ChIP-seq基本分析流程）、單細(xì)胞測(cè)序分析?(重磅綜述：三萬字長文讀懂單細(xì)胞RNA測(cè)序分析的最佳實(shí)踐教程 （原理、代碼和評(píng)述）)、DNA甲基化分析、重測(cè)序分析、GEO數(shù)據(jù)挖掘（典型醫(yī)學(xué)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)GEO數(shù)據(jù)分析 (step-by-step) - Limma差異分析、火山圖、功能富集）等內(nèi)容。

鑒定差異表達(dá)基因是許多生物醫(yī)學(xué)研究項(xiàng)目的基礎(chǔ)步驟，利用轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行差異表達(dá)（Differential Expression, DE）分析是目前最主流的方法，得到了廣泛應(yīng)用。例如，兩個(gè)常用于轉(zhuǎn)錄組DE分析的算法 edgeR 和 DESeq2 已經(jīng)被引用了超過上萬次。

在DE分析中，如果使用的生物學(xué)重復(fù)數(shù)不足，會(huì)影響到結(jié)果的準(zhǔn)確性，生物統(tǒng)計(jì)學(xué)家們長期以來呼吁要提高重復(fù)數(shù)。然而，由于傳統(tǒng)轉(zhuǎn)錄組方法的實(shí)驗(yàn)流程較為復(fù)雜昂貴，大多數(shù)研究?jī)H使用 2-3 對(duì)生物學(xué)重復(fù)。使用這么少重復(fù)數(shù)的分析，敏感性（sensitivity）較低，只有差異表達(dá)最顯著的基因才能被鑒定出來；錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）也很高，結(jié)果中存在大量的假陽性。因此，需要一種新的實(shí)驗(yàn)方法，有效解決生物學(xué)重復(fù)不足的問題，提高DE分析的準(zhǔn)確性。【生物重復(fù)對(duì)差異基因鑒定的影響評(píng)估見本次推文次條】

中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所屠強(qiáng)研究組開發(fā)了一種新的轉(zhuǎn)錄組實(shí)驗(yàn)方法，稱為Decode-seq。該方法利用多種分子標(biāo)簽，可以在一個(gè)測(cè)序文庫中同時(shí)檢測(cè)數(shù)十個(gè)樣品，大幅降低了建庫成本；富集轉(zhuǎn)錄本5’端測(cè)序，相比全長測(cè)序降低了測(cè)序成本，也避免了3‘端測(cè)序造成的困難；文庫結(jié)構(gòu)兼容通用測(cè)序流程，不需要定制參數(shù)，可以與任意標(biāo)準(zhǔn)文庫同時(shí)上機(jī)，因此對(duì)測(cè)序量要求也非常靈活。與傳統(tǒng)轉(zhuǎn)錄組方法相比，Decode-seq的成本降低到約10%，非常適用于大規(guī)模的DE分析。在驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，使用30對(duì)重復(fù)的DE分析結(jié)果相對(duì)于3對(duì)重復(fù)，敏感性從31% 提高到 95%，錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率從 34% 降低到 14%，顯著改善了結(jié)果的準(zhǔn)確性。Decode-seq 方法還可以應(yīng)用于微量樣品，例如對(duì)青鳉魚發(fā)育早期的雌雄性腺進(jìn)行多達(dá)30對(duì)重復(fù)的轉(zhuǎn)錄組分析，鑒定出了多個(gè)雌雄差異表達(dá)基因，其中一些被證明對(duì)生殖細(xì)胞的正常發(fā)育是必須的。

綜合這些結(jié)果可知，大幅增加生物學(xué)重復(fù)可以顯著提高差異表達(dá)基因鑒定的準(zhǔn)確性，而Decode-seq 為此提供了一個(gè)可行的實(shí)驗(yàn)方法。因此，除非因樣品珍貴、需要研究轉(zhuǎn)錄本全長等原因，否則應(yīng)避免僅使用2-3對(duì)生物學(xué)重復(fù)的轉(zhuǎn)錄組分析策略。Decode-seq 方法的實(shí)驗(yàn)流程和分析程序都已經(jīng)在研究組主頁（https://github.com/QTuLab）上提供下載。

該成果于2020年3月23日正式發(fā)表于 Genome Biology 雜志(DOI:10.1186/s13059-020-01966-9)，文章標(biāo)題為“Decode-seq: a practical approach to improve differential gene expression analysis”。屠強(qiáng)研究組博士研究生李瑩姝為該論文的第一作者，屠強(qiáng)研究員為該論文的通訊作者。該研究得到國家自然基金和中科院先導(dǎo)項(xiàng)目的資助。

圖：(a-b) 使用3對(duì)和30對(duì)重復(fù)的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，紅色為真陽性，黃色為假陽性，灰色為真陰性，藍(lán)色為假陰性。? 對(duì)30對(duì)重復(fù)的結(jié)果進(jìn)行抽樣計(jì)算表明，隨著重復(fù)數(shù)的增加，差異基因鑒定的準(zhǔn)確性也得到了大幅提高。

總結(jié)

以上是生活随笔為你收集整理的遗传所屠强研究组开发Decode-seq方法显著提高差异表达基因分析的准确性的全部?jī)?nèi)容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問題。

如果覺得生活随笔網(wǎng)站內(nèi)容還不錯(cuò)，歡迎將生活随笔推薦給好友。