2019年，加拿大滑鐵盧大學劉玨文團隊在Angewa雜志發表文章“DNA寡核苷酸的冷凍定向拉伸和排列”。研究發現冷凍可以拉伸DNA，并且核酸鏈與核酸鏈之間的側向相互作用起重要作用，拉伸DNA寡核苷酸排列。同時冷凍可以使DNA寡核苷酸很容易的吸附在納米材料上，通過穩定的熱力學構象，導致更穩定共軛配合。

具有識別和催化作用的DNA分子(aptamers, DNAzymes, DNA hybridization probes)一般以典型的單鏈形式存在，但是單鏈DNA的長度僅僅是幾個堿基的長度(小于1nm)，因此控制單鏈DNA的構象是非常困難的問題。作者為了監測單鏈DNA的構象采用冷凍的方法，并首先通過FRET證明。30-mer的隨機核酸序列兩端分別標記Cy3和Cy5，其中Cy3黃色發射是FRET的供體，Cy5紅色發射是FRET的受體。在低鹽條件下，溶液呈現黃色熒光，說明發射主要來自Cy3，DNA是一個舒展的狀態，FRET發射概率低。隨著鹽濃度的增加，發射逐漸轉變成紅色，這是由于鹽的加入降低了DNA分子間的電荷排斥作用，壓縮了DNA，提高了FRET的效率(圖1a)。而上述不同鹽濃度的核酸溶液經冷凍快速成像，可以發現所用的樣品呈現紅色熒光。這是由于冷凍使鹽和核酸得到濃縮，增加了FRET效率(圖1c)。向溶液中加入200倍的非標記30mer的隨機核酸序列使得標記的DNA直接相互作用最小化，冷凍之前FRET依賴鹽濃度的影響時非常小的，而冷凍之后發現所有的樣品與鹽濃度無關都呈現黃色，這是由于冷凍拉伸了DNA(圖1d)。

上述的FRET是通過共價標記熒光基團進行的，為了排除標記的干擾，選擇甲基橙染料進行實驗。其中甲基橙和DNA的量子產率順序是quadruplex>dsDNA>ssDNA。以此為基礎進行實驗，在室溫條件下G15顯示最高的熒光，冷凍之后A15同樣顯示出較強的熒光，這可能是由于冷凍使得polyA按照有序的結構進行排列(圖2)。因為在酸性條件下polyA是以平行雙鏈的形式存在，所以推測冷凍的排列結構可以能與其類似。

圖1. 通過FRET證明探針DNA1的構象

圖2. 通過TO染色證明探針DNA的構象

為了證明polyA的排列方式首先證明形成熒光的polyA的最低組成堿基個數，由圖2c可知，在AMP的冷凍條件下就有微弱的熒光，隨著堿基個數的增加，熒光逐漸增加，當堿基個數達到15時，熒光呈現飽和狀態。所以排列方式應該是鏈間的相互作用，而不是末端的相互堆疊。同時圖2b中polyC和polyT冷凍后也沒有熒光，這可能是由TO不能對其進行染色所致，因此在序列的兩端加上帶有A的帽子，結果如圖2c所示，證明polyT在冷凍狀態下也是按照某種特定排列方式進行排列的。

同時為了測量DNA在冷凍狀態下的排列數量，選擇兩種不互補的長12mer的DNA進行實驗，一種標記熒光基團，一種標記猝滅基團。如果一種類似雙螺旋的復合體形成熒光會猝滅1/6左右，圖3a結果顯示當DNA以1:1的比例加入到反應體系中熒光猝滅在60%左右，因此證明在冷凍狀態下超過兩條鏈之間相互結合(圖3c)。

圖3. a)兩種非互補DNA的可能排列；b) 在冷凍狀態下通過FAM-12-DNA和不同比例的Q-12DNA的熒光比例；c) 顯示DNA在多聚體中排列的機制；d) 顯示DNA模板形成AuNPs的機制和在冰上TEM成像e)，在溶液中成像f)；g) DNA-PEI復合物的機制和TEM成像，在冰上h),在溶液中i)

為了獲得更直接的TEM成像，首先解決了在冰上成像短DNA序列的難題，文中通過兩種方法，一種是通過ssDNA與HAuCl4在冰上原位形成AuNPs，另一種是通過PEI與DNA形成復合物，兩種方法都獲得了較好的實驗結果，更加直觀的證明了寡核苷酸鏈在冷凍狀態下有序排列。

同時DNA功能化的納米材料在生物傳感發展、直接組裝和藥物遞送過程中是最重要的試劑。當DNA與納米材料表面相互作用時，DNA的吸附構象可能不是最穩定的熱力學狀態，因此DNA的構象可能極大的影響吸附狀態，進而反過來會影響吸附DNA的強度、穩定性和活性。因此將拉伸單鏈DNA使得他們的吸附更一致，共軛配合的能力更高是非常有意義的事情。因此本文選取四種代表性的納米材料，研究冷凍對于他們的吸附產生的影響。由圖4b可知四種納米材料都是陰性納米材料自身基本不能吸附DNA，但是在高鹽條件下可以中和掉DNA骨架上的陰離子使得DNA易于吸附在納米材料上，低鹽冷凍狀態下同樣可以使DNA吸附在納米材料上(圖4c)。同時圖4d表明經冷凍后鏈接上核酸序列之，再溶解納米材料的穩定性良好。接下來以DNA/GO為實例進行驗證，FAM DNA/GO首先準備通過300mM的NaCl和無鹽冷凍的兩種方式進行交聯。然后用相同的沒有標記的DNA置換FAM DNA。通過冷凍制備的樣品置換速率是更緩慢的(圖4e)，證明冷凍的吸附能力是更強的。這些結果均表明拉伸的DNA在冷凍定向吸附時保持其構象，并且更多的核堿基可與GO表面相互作用。

圖4. a) 冷凍調控DNA吸附；b)納米材料的ξ電勢；c) 沒有鹽的DNA吸附能力，300mM NaCl的的吸附能力，以及無鹽冷凍狀態下的吸附能力； d) 納米材料在冷凍后溶解的穩定性展示； e) 通過添加相同的DNA但不含FAM標記(500nM)從GO(10ug/mL)置換FAM-DNA(50nM)的動力學

點評：

1.文中提出冷凍調控DNA寡核苷酸的拉伸和排列的觀點，并且通過FRET，染料法和表面增強拉曼光譜成像等多方面證明，其實驗結論真實可信。

2.其中在冷凍狀態下對短核酸鏈的染色方法值得學習借鑒，并且解決了TEM成像困難的難題，使推測的冷凍拉伸、排列的結論更直觀、準確的得到驗證。

3.納米材料與功能核酸的結合目前已經在生物傳感、藥物的遞送、體內成像等方面廣泛應用，文中提出冷凍可以提高其結合能力，并且拉伸構象，使其均一排列，這種方法可以解決核酸與納米材料吸附不穩定、構象變化復雜等問題。

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Liu, B., Wu, T., Huang, Z., Liu, Y., & Liu, J. (2019). Freezing‐directed Stretching and Alignment of DNA Oligonucleotides. Angewandte Chemie, 131(7), 2131-2135.

總結

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