在講測序原理之前，需要有一些最基本的生物知識了解

1）雖然DNA鏈很長，但是RNA可能比較短，因為有些基因轉錄了，有些基因沒有轉錄

2）一個DNA上有許多基因片段，每個基因片段的DNA鏈能轉錄出一種mRNA，一種mRNA能翻譯出一種蛋白質

3）轉錄時RNA聚合酶一般只轉錄一個基因

4）每個細胞內RNA可能是不同的，因為不同細胞基因表達情況不同

對轉錄組測序，我們需要對細胞內轉錄組的情況有一定的了解。我們帶著問題去尋找答案

第一：RNA到底測的什么？

mRNA在生物個體內 RNA的組分中只占很小的一部分，rRNA占絕大多數。一般我們說 RNA-seq指的都是mRNA-seq，后面的流程也都是主要針對mRNA-seq數據分析的。在科 學家們的努力下，可以把那些非編碼 RNA提取出來建庫，進行測序。 一個成功的 RNA-seq研究，起決定性因素的是一個好的實驗設計。還依賴于建庫的類型、測 序深度和設置適于的生物重復。并且盡量減少測序本身以外帶來的數據誤差

第二：文庫構建

一般生物體中的的 RNA中，rRNA占絕大多數，含量超過 90%，而mRNA的含量在 1-2%，左右，轉錄組測序文庫是以樣本的Total RNA為基礎，從中提取mRNA構建測序文庫，因此文庫構建包括mRNA富集和碎片化、mRNA反轉錄、接頭添加和PCR富集等過程

mRNA富集

在生物的Total RNA中，mRNA所占比例很低，絕大部份時核糖體RNA (rRNA)，因此如果直接使用Total RNA進行測序，得到的結果必然是不準確的，因此需要先將Total RNA中的mRNA分類純化出來。

轉錄組測序的文庫根據待測樣品的物種分為真核轉錄組和原核轉錄組。由于真核生物和原核生物mRNA結構不同，因此在mRNA富集時所采用的方法也并不相同。

真核生物mRNA中含有polyA尾結構，因此可以使用oligoT與其特異性的匹配，從而在Total RNA中特異性的富集mRNA。

然而，原核生物并不像真核生物mRNA具有polyA的結構，因此，無法直接利用oligoT將mRNA純化出來，目前，提高原核生物中mRNA的量，最主要的方式是去除Total RNA中rRNA。

由于測序儀器不能直接對RNA測序，所以還要反轉錄成cDNA

鏈特異性文庫

由于轉錄組文庫構建過程中要將mRNA反轉錄為雙鏈的cDNA，因此，在測序時，即會同時得到cDNA雙鏈的序列信息，這就消除了mRNA單鏈的特性，無法區分cDNA中的正義鏈和反義鏈。

因此提出了另一種文庫構建方式，鏈特異性文庫，其在文庫制備和測序中保留mRNA 的方向信息，使得有效數據增多，基因表達定量更準確；基因注釋更準確，新基因識別等分析更可靠；同該方法能夠鑒定與開放閱讀框反義的ncRNA、發現反義轉錄本。

其建庫原理與普通轉錄組類似，不同之處在于合成第二鏈cDNA時，用dUTP代替dTTP，此時第二鏈cDNA上布滿了含dUTP的位點。

在接頭連接后用一種特定的酶，其可在尿嘧啶位置產生一個單核苷酸缺口，從而消化掉第二鏈cDNA，只保留第一鏈cDNA，隨后進行PCR擴增純化，得到只含第一鏈cDNA信息的文庫。

總結

以上是生活随笔為你收集整理的和rna用什么鉴定_RNA-seq：测序原理之文库构建的全部內容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問題。

如果覺得生活随笔網站內容還不錯，歡迎將生活随笔推薦給好友。