原位PCR有間接法和直接法兩種：間接法是先在細(xì)胞內(nèi)對DNA分子原位擴(kuò)增，而后進(jìn)行原位雜交；直接法是將標(biāo)記的核苷(放射性同位素或熒光素標(biāo)記的引物)在原位擴(kuò)增之前加入PCR反應(yīng)液中，在擴(kuò)增過程中，標(biāo)記的核苷酸直接摻入PCR產(chǎn)物中，然后用放射自顯影、免疫組織化學(xué)或熒光檢測技術(shù)進(jìn)行DNA的定位與檢測。原位PCR的基本步驟是：① 固定細(xì)胞，盡量保存細(xì)胞固有的形態(tài)與結(jié)構(gòu)；② 蛋白酶消化：用胃蛋白酶、蛋白酶K等消化固定后的蛋白質(zhì)交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)屏障，使PCR反應(yīng)試劑與靶DNA充分接觸；③ 原位PCR擴(kuò)增；④ 產(chǎn)物檢測：直接法可用放射自顯影、免疫組織化學(xué)或熒光檢測等，間接法需用特異性標(biāo)記探針進(jìn)行引物雜交。

原位PCR大致過程，實(shí)驗(yàn)用的標(biāo)本是新鮮組織、石蠟包埋組織、脫落細(xì)胞、血細(xì)胞等。其基本方法為多聚甲醛固定組織或細(xì)胞，蛋白酶消化處理組織；在組織細(xì)胞片上滴加PCR反應(yīng)液進(jìn)行擴(kuò)增，覆蓋并加液體石蠟后，在原位PCR儀上進(jìn)行PCR循環(huán)擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增結(jié)束后用標(biāo)記的探針進(jìn)行原位雜交，最后顯微鏡觀察結(jié)果。原位PCR技術(shù)可分為直接法和間接法兩大類，此外，還有反轉(zhuǎn)錄原位PCR技術(shù)等，原位反轉(zhuǎn)錄 PCR(in situ reverse transcription PCR, In Situ RT-PCR)是將液相的RT-PCR技術(shù)應(yīng)用到組織細(xì)胞標(biāo)本中的一種新技術(shù)，與RT-PCR（液相）不同點(diǎn)在于，進(jìn)行原位反轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)之前，組織標(biāo)本要先用DNA酶處理，以破壞組織中的DNA酶，這樣才能保證擴(kuò)增的模板是從mRNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA，而不是細(xì)胞中原有的DNA。其它基本步驟與液相的RT-PCR相似。

總結(jié)

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