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PCR过程出现假阳性,原因有哪些呢?该如何杜绝PCR出现假阳性呢?

發布時間:2023/11/24 万象百科 133 博士
生活随笔 收集整理的這篇文章主要介紹了 PCR过程出现假阳性,原因有哪些呢?该如何杜绝PCR出现假阳性呢? 小編覺得挺不錯的,現在分享給大家,幫大家做個參考.
樓上已經把原因都說的很清楚了,針對可能造成PCR假陽性的實驗操作,我們可以從以下幾方面避免:1.隔離不同操作區。PCR反應準備最好應在裝有紫外燈的超凈臺內進行,除了操作分區外,還應注意操作器材的專用。2.分裝試劑。PCR用的去離子水和緩沖液均應高壓處理。3.嚴格實驗操作。戴一次性手套操作,避免反應液的飛濺,用一次性吸頭,吸頭不要暴露于空氣中,防止產物氣溶膠的污染。4.最后加樣品DNA,加入DNA后蓋緊EP管。5. 在排除污染的前提下,最好的解決空白對照組中出現“假陽性”的辦法就是把引物和酶的含量降到盡可能低,同時減少反應循環次數(但在保證陽性對照組能夠出現條帶的前提下);實驗器材及試劑最好全部用進口的。

(1)若是對照組,即無菌水空出現假陽性。建議加完9ul的mix后,先加水后加樣品。避免樣品濃度過高飛濺到移液槍中,從而在加水的時候進入到孔中。(2)稀釋標準品時所用的無菌水應和PCR時使用的無菌水分開,避免標準品因濃度過高進入移液器。(3)提取樣品的操作區應和PCR的操作區分開。提取樣品時使用的移液器、手套等不能帶入PCR操作區。

用PCR方法檢測轉基因成分時,經常出現假陽性、假陰性、非特異性擴增和涂抹帶。尤其是假陽性和假陰性可使檢測結果得出錯誤結論,有時可造成嚴重后果。造成假陽性的原因1. 樣品間交叉污染:樣本污染主要有收集樣本的容器被污染,或樣本放置時,由于密封不嚴溢于容器外,或容器外粘有樣本而造成相互間交叉污染;樣本核酸模板在提取過程中,由于吸樣槍污染導致標本 間污染;2. PCR試劑的污染:主要是由于在PCR試劑配制過程中,由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液 被PCR核酸模板污染。3. PCR擴增產物污染:這是PCR反應中最主要最常見的污染問題。因為PCR產物拷貝量大(一般為1013拷貝/ml),遠遠高于PCR檢測數個拷貝的極限,所以極微量的PCR產物污染,就可形成假陽性。 4. 氣溶膠污染:在空氣與液體面摩 擦時就可形成氣溶膠,在操作時比較劇烈地搖動反應管,開蓋時、吸樣時及污染進樣槍的反復吸樣都可形成氣溶膠而污染。據計算一個氣溶膠顆粒可含48000拷貝,因而由 其造成的污染是一個值得特別重視的問題。5. 實驗室中克隆質粒的污染:由于克隆質粒在單位容積內含量相當高,另外在純化過程中需用較多的用具及試劑,而且在活細胞內的質粒,由于活細胞的生長繁殖的簡便性及具有很強的生命力,其污染可 能性也很大。在分子生物學實驗室及某些用克隆質粒做陽性對照的檢驗室,這個問題比較常見。

總結

以上是生活随笔為你收集整理的PCR过程出现假阳性,原因有哪些呢?该如何杜绝PCR出现假阳性呢?的全部內容,希望文章能夠幫你解決所遇到的問題。

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