既然基因序列已知，就根據(jù)ATG。。。。TAG設(shè)計引物好了，這樣克隆出來可以直接連到表達載體。可以用PRIMER5.0設(shè)計，也可以自己手動設(shè)計，要注意的就是兩個引物退火溫度不能相差太大，設(shè)計酶切位點的時候要注意克隆出來的基因連到載體上不能移碼突變。檢測cds序列可以用的酶切位點，上游引物：保護堿基+酶切位點+起始密碼+引物，下游引物：保護堿基+酶切位點+終止密碼+引物

既然已知其CDS序列的，就可以將該序列導(dǎo)入到引物設(shè)計軟件中，設(shè)計好參數(shù)即可。 引物設(shè)計的軟件，有在線的，也有需要下載安裝的，例如DNA STAR和primer premier等。然后根據(jù)設(shè)計原則在軟件中選擇合適的參數(shù)就可以了。 引物設(shè)計的原則有： 1. 引物的長度一般為15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不應(yīng)大于38，因為過長會導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，不適于Taq DNA聚合酶進行反應(yīng)。 2. 引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯配。引物3’端出現(xiàn)3個以上的連續(xù)堿基，如GGG或CCC，也會使錯誤引發(fā)機率增加。 3. 引物3’端的末位堿基對Taq酶的DNA合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯配位置導(dǎo)致不同的擴增效率，末位堿基為A的錯配效率明顯高于其他3個堿基，因此應(yīng)當(dāng)避免在引物的3’端使用堿基A。另外，引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR反應(yīng)失敗。5’端序列對PCR影響不太大，因此常用來引進修飾位點或標記物。 4. 引物序列的GC含量一般為40-60%，過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太 大。 5. 引物所對應(yīng)模板位置序列的Tm值在72℃左右可使復(fù)性條件最佳。Tm值的計算有多種方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo軟件中使用的是最鄰近法(the nearest neighbor method)。 6. ΔG值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對的相對穩(wěn)定性。應(yīng)當(dāng)選用3’端ΔG值較低（絕對值不超過9），而5’端和中間ΔG值相對較高的引物。引物的3’端的ΔG值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA聚合反應(yīng)。 7. 引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值過高（超過4.5kcal/mol）易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR反應(yīng)不能正常進行。 8. 對引物的修飾一般是在5’端增加酶切位點，應(yīng)根據(jù)下一步實驗中要插入PCR產(chǎn)物的載體的相應(yīng)序列而確定。 若想了解更多信息，這里有個專欄。http://www.bbioo.com/experiment/12-810-1.html。

原核的直接克隆。真核的先提提RNA來做定量分析，cds區(qū)克隆先提rna逆轉(zhuǎn)錄，設(shè)計cds區(qū)引物來pcr然后粗略的測測序有個底，然后通過T載體連接到質(zhì)粒上，最后導(dǎo)入目的菌里面表達，然后提出表達物來驗證！大概思路是這樣子的，僅供參考。

總結(jié)

以上是生活随笔為你收集整理的已知酶的cds序列和全基因组序列,引物该如何设计？的全部內(nèi)容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問題。

如果覺得生活随笔網(wǎng)站內(nèi)容還不錯，歡迎將生活随笔推薦給好友。