可以利用TALEN(Transcription Activator-Like Effector Nuclease) 技術(shù)。它基于對DNA識別域 (TALEN 結(jié)合臂) 和人工改造的核酸內(nèi)切酶的切割域(FokⅠ)的結(jié)合對細(xì)胞基因組進(jìn)行修飾而實(shí)現(xiàn)的。TALEN的DNA識別域是由一些非常保守的重復(fù)氨基酸序列模塊組成，每個模塊由34個氨基酸組成，其中第12和13位的氨基酸種類為可變的（RVDs），且決定了該模塊識別靶向位點(diǎn)的特異性。通過DNA識別域結(jié)合到靶位點(diǎn)上，以及FokI的切割域形成二聚體后，可特異性對目標(biāo)基因DNA實(shí)現(xiàn)切斷，在非同源末端連接修復(fù)過程中，DNA雙鏈斷開后會由于堿基的隨機(jī)增減造成目標(biāo)基因功能缺失。 該技術(shù)目前已成功應(yīng)用于植物、細(xì)胞、酵母、斑馬魚及大、小鼠等各類模式動物的研究領(lǐng)域。TALEN由四部分組成：N端序列，RVD，C端序列，F(xiàn)okI。利用Type II 限制性內(nèi)切酶可以將RVDs模塊分別生成不同的粘性末端，同時(shí)又不留有酶切位點(diǎn)， 通過一系列的相應(yīng)酶切連接反應(yīng)實(shí)現(xiàn)RVDs與TALEN骨架的無縫連接。 TALEN系統(tǒng)利用FokI的內(nèi)切酶活性打斷目標(biāo)基因。FokI形成二聚體發(fā)揮活性，在TALEN結(jié)合臂的引導(dǎo)下，發(fā)揮特異性內(nèi)切酶活性，在兩個靶位點(diǎn)之間剪切DNA，形成DSB（Double- Strand Breaks）,誘發(fā)DNA損傷修復(fù)機(jī)制。細(xì)胞通過NHEJ（Non- homologous End Joining）修復(fù)DNA，在此修飾過程中導(dǎo)致刪除或插入了一定數(shù)目（非3的倍數(shù)）的堿基，造成移碼，形成對目標(biāo)基因特異性KO的突變體。這個技術(shù)已經(jīng)比較成熟了，很多生物公司都有在做。華師生科院有教授就是研究這個技術(shù)的。

是可以實(shí)現(xiàn)的，并且從很多文獻(xiàn)資料來看這一技術(shù)以及受到科研工作者極大地關(guān)注，很多文章均已發(fā)表在《美國科學(xué)院院刊》上。越來越多的科學(xué)家企圖通過這一方法來研究基因的功能極其多表達(dá)的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。其前景也是極其可觀的。

能夠進(jìn)行定向突變。隨著重組DNA技術(shù)、DNA序列分析技術(shù)、寡聚核苷酸合成技術(shù)以及其他分子生物學(xué)技術(shù)的不斷完善和發(fā)展，人們能夠在離體條件下，有目的地制造位點(diǎn)特異性突變，即離體定向誘發(fā)突變，如定向地制造特異性的缺失、插入、堿基替換或移碼突變等各種突變。我們把這種人工合成的寡聚核苷酸在離體條件下制造任何部分的位點(diǎn)特異性突變的技術(shù)叫做定點(diǎn)突變或稱定點(diǎn)誘變。此技術(shù)一般步驟為：①人工合成一條包括靶堿基及其附近序列的寡核苷酸，這條寡核苷酸鏈除了要替換的靶堿基外，其余的序列與野生型DNA分子的相應(yīng)序列完全相同；②將它與單鏈?zhǔn)删wM13所攜帶的DNA克隆的互補(bǔ)單鏈混合進(jìn)行分子雜交，在DNA聚合酶Ⅰklenow片段的作用下合成完整的互補(bǔ)鏈，再用DNA連接酶連接；③將此雙鏈DNA導(dǎo)入到宿主大腸桿菌中，經(jīng)修復(fù)和DNA復(fù)制后就可得到穩(wěn)定遺傳的突變的DNA分子克隆，在產(chǎn)生的子代DNA中大約有10%～15%為所需要的突變的DNA分子；④通過等位基因替換(或其他)的方法將突變基因送回細(xì)胞內(nèi)原來的基因組中。這樣就可以得到定向突變產(chǎn)生的相關(guān)基因片段。由此可知，通過人工技術(shù)，可以對基因進(jìn)行定向誘變。現(xiàn)在采用定點(diǎn)突變方法來研究基因或蛋白質(zhì)功能的技術(shù)已經(jīng)很成熟，可以廣泛的應(yīng)用到各個領(lǐng)域。

可以。 定點(diǎn)突變是指通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因組，也可以是質(zhì)粒）中引入所需變化（通常是表征有利方向的變化），包括堿基的添加、刪除、點(diǎn)突變等。定點(diǎn)突變能迅速、高效的提高DNA所表達(dá)的目的蛋白的性狀及表征，是基因研究工作中一種非常有用的手段。 定點(diǎn)突變一般需有含有待突變基因的高純度質(zhì)粒，不少于10μg，電泳圖清晰，達(dá)酶切及測序要求。其流程為： 1.對待突變基因測序結(jié)果進(jìn)行分析，設(shè)計(jì)突變方案； 2.根據(jù)突變方案設(shè)計(jì)合成覆蓋突變位點(diǎn)的雙向引物，合成目的DNA兩端引物，進(jìn)行高保真PCR反應(yīng)； 3.默認(rèn)情況下，將PCR產(chǎn)物克隆至T載，或者根據(jù)要求亞克隆至目的載體；DNA測序驗(yàn)證突變序列的正確性。 對于單點(diǎn)突變，Stratagene公司的QuikChange Site-directed Mutagenesis kit是不錯的選擇，通過巧妙設(shè)計(jì)，將質(zhì)粒定點(diǎn)突變技術(shù)變得簡單有效。準(zhǔn)備突變的質(zhì)粒必須是從常規(guī)E.coli中經(jīng)純化試劑盒(Miniprep)或者氯化銫純化抽提的質(zhì)粒。設(shè)計(jì)一對包含突變位點(diǎn)的引物（正、反向），和模版質(zhì)粒退火后用PfuTurbo聚合酶“循環(huán)延伸”，(所謂的循環(huán)延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回到引物5’端終止，再經(jīng)過反復(fù)加熱褪火延伸的循環(huán)，這個反應(yīng)區(qū)別于滾環(huán)擴(kuò)增，不會形成多個串聯(lián)拷貝。)正反向引物的延伸產(chǎn)物退火后配對成為帶缺刻的開環(huán)質(zhì)粒。DpnI酶切延伸產(chǎn)物，由于原來的模版質(zhì)粒來源于常規(guī)大腸桿菌，是經(jīng)dam甲基化修飾的，對DpnI敏感而被切碎（DpnI識別序列為甲基化的GATC，GATC在幾乎各種質(zhì)粒中都會出現(xiàn)，而且不止一次），而體外合成的帶突變序列的質(zhì)粒由于沒有甲基化而不被切開，因此在隨后的轉(zhuǎn)化中得以成功轉(zhuǎn)化，即可得到突變質(zhì)粒的克隆。這個試劑盒非常巧妙的利用甲基化的模版質(zhì)粒對DpnI敏感而合成的突變質(zhì)粒對DpnI酶切不敏感，利用酶切除去模版質(zhì)粒，得到突變質(zhì)粒，使得操作簡單有效。另外由于Pfu聚合酶是公認(rèn)的最好的高保真聚合酶之一，堪稱高保真聚合酶的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”，是Stratagene的看家之寶，能夠有效避免延伸過程中不需要的錯配。試劑盒采用的是低次數(shù)的循環(huán)延伸而非PCR，有助于減少無意錯配。只需要一次酶切和轉(zhuǎn)化，實(shí)驗(yàn)可以在一天完成。這個試劑盒適用于質(zhì)粒大小不超過8Kb的質(zhì)粒。后來推出的QuikChange XL site-directed mutagenesis kit則是針對大于8Kb的質(zhì)粒的定點(diǎn)突變的，通過優(yōu)化試劑特別是其感受態(tài)細(xì)胞（XL10-Gold），使得較大的質(zhì)粒的定點(diǎn)突變也一樣簡單。QuikChange由于操作簡單快速，效率高（ >80%）而受到普遍歡迎，光是2012年的前9個月就有超過400篇發(fā)表的論文中用到這個產(chǎn)品。 有的時(shí)候研究可能需要多個位點(diǎn)的定點(diǎn)突變，比如改造酶的活性或者動力學(xué)特性，研究蛋白之間的相互作用位點(diǎn)等，單點(diǎn)突變不能滿足實(shí)驗(yàn)的需要，重復(fù)進(jìn)行單點(diǎn)突變也非常浪費(fèi)時(shí)間。因而Stratagene公司又推出了QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis kit。最多一次實(shí)驗(yàn)可以引入5個定點(diǎn)突變。這個試劑盒的原理和Clontech的相似，就是準(zhǔn)備多個帶突變的引物（同方向，對同一單鏈模版），退火后全部突變引物（不超過5個）都結(jié)合在同一環(huán)狀單鏈模版，PfuTurbo聚合酶延伸，碰到下一個引物就停止，各片斷經(jīng)連接成環(huán)，和單鏈模版組成雜和環(huán)，DpnI消化雙鏈模版，也消化雜和環(huán)中的模版，只留下新合成的帶多個突變的單鏈環(huán)（mutant ssDNA），得以轉(zhuǎn)化E.coli，形成雙鏈質(zhì)粒。資料表明，引入3個定點(diǎn)突變的效率為60%，5個定點(diǎn)突變的效率為30%。得到的其他質(zhì)粒是帶有較少定點(diǎn)突變的質(zhì)粒，以引入3個定點(diǎn)突變?yōu)槔褪怯?0% 左右的轉(zhuǎn)化質(zhì)粒是帶有1—2個不同定點(diǎn)突變的質(zhì)粒（因?yàn)榇嬖?—2個引物結(jié)合模版延伸形成單鏈環(huán)的可能）。這樣，一次實(shí)驗(yàn)可以得到不同數(shù)目突變的質(zhì)粒，對于研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系也是有用的。 幾乎每個生物實(shí)驗(yàn)室都會用定點(diǎn)突變法來研究基因或蛋白質(zhì)的功能。定點(diǎn)突變法不僅廣泛用于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，還可用于農(nóng)業(yè)培育抗蟲、抗病的良種，用于醫(yī)學(xué)矯正遺傳病、治療癌癥等病。

總結(jié)

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