不同產(chǎn)地佛手指紋圖譜及模式識別研究

吳春蓉^1,2,3,黎珊珊^1,2,3,肖雪^1,2＊＊,樸勝華^1,2＊＊,郭姣^1,2

摘 要：目的：建立不同產(chǎn)地佛手指紋圖譜，利用模式識別方法比較不同產(chǎn)地佛手的差異。方法：本文采用高效液相色譜法對4個產(chǎn)地25批佛手建立高效液相指紋圖譜，利用相似度評價技術(shù)、聚類分析、主成分分析進行分析研究。結(jié)果：從已建立的佛手指紋圖譜中確定26個共有峰，指認出4個共有峰，利用聚類分析、主成分分析可區(qū)分佛手產(chǎn)地。結(jié)論：研究結(jié)果表明，不同地理位置佛手藥材相似度存在一定差異，地理位置相近的佛手藥材相似度較高。

---

佛手為蕓香科植物佛手Citrus medica L.var. Sarco-dactylis Swingle的干燥果實，其味辛、苦、酸、溫，歸肝、脾、胃、肺經(jīng)，具有疏肝理氣、和胃止痛、燥濕化痰的功效。目前研究表明佛手具有抗氧化、抗炎、抗菌、降脂，抗腫瘤等多種藥理作用，其作為原材料被廣泛用于藥品、保健品、食品。《中國藥典》采用顯微鑒別、薄層色譜及橙皮苷含量評價佛手質(zhì)量，而佛手成分復(fù)雜，產(chǎn)地眾多，品質(zhì)參差不齊，諸如以上方法無法全面表征佛手質(zhì)量。指紋圖譜在中藥質(zhì)量評價中正在被廣泛應(yīng)用，它可充分地反映中藥中各化學(xué)成分分布的整體狀況。聚類分析是一種無監(jiān)督的多元統(tǒng)計方法，能夠依據(jù)各自特征進行合理分類。主成分分析通過降維，可用較少的主成分來反映原始指標(biāo)的主要信息。目前指紋圖譜結(jié)合模式識別來反映中藥不同產(chǎn)地間差異及內(nèi)在質(zhì)量的方法已經(jīng)被廣泛應(yīng)用。林樂維等，張瑞芳等分別建立了廣佛手高效液相指紋圖譜，結(jié)果顯示廣東地區(qū)佛手差異性較小，除此之外，全國其他產(chǎn)區(qū)佛手綜合研究相對較少。本文首次采用高效液相(High performance liquid chromatog?raphy，HPLC)指紋圖譜技術(shù)結(jié)合模式識別方法分析不同產(chǎn)地多批次佛手間的差異，為評價不同產(chǎn)地佛手質(zhì)量及其應(yīng)用提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

Waters alliance e2695高效液相色譜儀，配備e2695分離模塊，柱溫箱，2998 PDA檢測器，Empower色譜工作站(美國 Waters 公司)；KQ5200E 型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；ELGA超純水機(法國威立雅集團)；Sartorius BS110S萬分之一電子天平(德國賽多利斯集團)；LD-200型高速多功能粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)；2012 版中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(國家藥典委員會)。對照品橙皮苷(批號：wkq15123105)、甲基橙皮苷(批號：wkq151222002)、新橙皮苷(批號：wkq16041804)、橙皮素(批號：wkq16071104)均購自四川省維克奇生物科技有限公司，純度均≥98%。甲醇(色譜純，美國Merck 公司)；乙酸(色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑公司)；水為超純水，其余試劑為分析純。佛手藥材均為市售，經(jīng)廣東藥科大學(xué)李鐘副教授鑒定為蕓香科植物佛手Citrus medica L. var. Sarcodactylis Swingle的干燥果實。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液制備取本品適量，粉碎，過 65 目篩，取約 2 g，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇20 mL，稱定重量，超聲提取2次，每次30 min，放冷，甲醇補足重量，將兩次提取液混合，濃縮至20 mL 定容，用 0.45μm微孔濾膜濾過備用。

2.2 對照品溶液制備

精密稱取對照品適量，置20 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，分別制成每1 mL含橙皮苷532.0 μg、橙皮素507.0 μg、甲基橙皮苷508.5 μg、新橙皮苷530.0 μg的溶液，經(jīng)0.45 μm的微孔濾膜濾過，即得。

2.3 色譜條件

色譜柱為 Sharpsil-U C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為甲醇(A)-0.2% 乙酸水(B)(pH=3.30)；洗脫方法為(0-14 min：5%-27%B；14-19 min：27%-44%B；19-45 min：44%-80%B)；流速為1 mL·min-1；檢測波長為254 nm；柱溫30℃；進樣量20 μL。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度考察取樣品GD01按“2.1”項所述方法制備佛手供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件進行檢測，連續(xù)進樣6針，記錄所得色譜圖。以峰24為參照峰計算相對保留時間和相對峰面積并計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果顯示，色譜峰的相對保留時間RSD均小于1.0%，相對峰面積的RSD均小于5.0%，表明儀器的精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性考察

取樣品GD01，按“2.1”項下方法平行制備6份佛手供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件進行檢測，各供試品溶液進樣分析，記錄所得色譜圖。結(jié)果顯示，色譜峰的相對保留時間RSD均小于1.0%，相對峰面積的RSD均小于5.0%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性考察

取樣品GD01，按“2.1”項下方法制備1份佛手供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件分別在0、2、4、6、8、12、24 h進行測定，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，色譜峰的相對保留時間RSD均小于1.0%，相對峰面積的RSD均小于5.0%，表明樣品24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 指紋圖譜的建立及評價分析

2.5.1 樣品及對照品測定分別取“1.1”中收集的 25 批佛手藥材和 4 種對照品，按“2.1”項所述方法制備溶液，按“2.3”項色譜條件進樣測定，記錄 HPLC 圖譜，25 批樣品色譜疊加圖如圖1。

2.5.2 參照峰的確定在各批次樣品圖譜24號色譜峰分離良好，峰面積較大且為所有樣品共有，確定甲基橙皮苷的色譜峰為參照峰。

2.5.3 佛手藥材指紋圖譜共有峰的確定

采用國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012年版)”對25批佛手藥材HPLC圖譜進行結(jié)果分析，確定26個共有峰，指認了其中4個色譜峰的歸屬：峰22為橙皮苷，峰23為新橙皮苷，峰24為甲基橙皮苷，峰26為橙皮素。

2.5.4 相似度評價

將所得25批佛手HPLC圖譜的cdf格式導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012 年版)”，選定GD01作為參照峰，時間窗口設(shè)為0.1 min，以中位數(shù)法建立對照指紋圖譜，如圖2；25批樣品與對照圖譜之間的相似度結(jié)果如表2。結(jié)果表明，收集到的25批不同產(chǎn)地的佛手具有一定的差異，廣東佛手相似度在0.846-0.978之間；廣西相似度在0.861-0.970之間；四川佛手相似度范圍為 0.811-0.926 之間；浙江相似度0.739-0.857之間。

2.6 模式識別分析

2.6.1 聚類分析(The cluster analysis，CA)對25批佛手進行聚類分析，獲得包括甲基橙皮苷(峰24)在內(nèi)的26個共有色譜峰，將各個共有峰面積導(dǎo)入SIMCA-P+13.0(Demo)軟件。根據(jù)聚類分析結(jié)果(圖3)，25批佛手樣品分為4類，其中SC02-S05及GD05聚為一類，ZJ01-ZJ03聚為一類，其余GX、GD交叉分布聚為兩類。

2.6.2 主成分分析(principal components analysis，PCA)

將25批佛手樣品所得峰面積導(dǎo)入SIMCA-P+13.0(Demo)，采用PCA方法進行分析，25批樣品的得分圖見圖 4。表明樣品間的聚類情況，25 批樣品可分為 4組，其中浙江與廣東、廣西、四川偏離較遠，四川與廣東、廣西有略微差異，廣西、廣東聚類程度較高，GD05和GD08為廣東產(chǎn)地的離群點，此結(jié)果與CA結(jié)果一致。

3 討論

3.1 樣品條件的選擇本文對不同提取方法(超聲、回流)進行了比較，并對不同的提取溶劑(10%、20%、40%、60%、80%、100%甲醇及水)以及提取次數(shù)(1 次、2 次)進行了試驗篩選。結(jié)果顯示，以80%甲醇為提取溶劑，采用超聲提取2次，每次30 min 時所得供試品溶液的色譜峰信息較為豐富，因此確定該條件為提取條件。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

本文分別對甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.2%乙酸水、乙腈-0.2%乙酸水等多種流動相系統(tǒng)，采用DAD全波長掃描進行考察，最終采用甲醇- 0.2%乙酸水(pH3.30)溶液為流動相梯度洗脫。同時檢測波長為254 nm，柱溫30℃時各色譜峰分離效果最好。

3.3 不同產(chǎn)地佛手對比

相似度評價表明同一產(chǎn)地佛手相似度較高，廣東、廣西相似度較為相近，四川佛手與兩廣佛手略有差異，浙江金佛手與兩廣、四川佛手均具有明顯差異，為了進一步說明不同產(chǎn)地佛手的聚類情況，在此基礎(chǔ)上采用CA、PCA方法對25批樣品進行分析，CA及PCA的結(jié)果與指紋圖譜的結(jié)果幾乎一致，表明不同區(qū)域的氣候條件、生態(tài)環(huán)境對其地域內(nèi)所產(chǎn)的藥材質(zhì)量有很大的影響。因此針對不同產(chǎn)地佛手之間的差異，對其應(yīng)用應(yīng)因地制宜。通過HPLC指紋圖譜及模式識別對佛手的綜合評價，既說明不同產(chǎn)地佛手的整體特征，反映其內(nèi)在質(zhì)量，又進一步結(jié)合模式識別方法分析不同產(chǎn)地佛手的聚類情況，使結(jié)果更科學(xué)、全面。對于不同產(chǎn)地佛手差異性成分，今后將做進一步的分析，期望能夠全面展示不同產(chǎn)地佛手之間的差異，為控制其內(nèi)在質(zhì)量提供依據(jù)。

文章來源：吳春蓉,黎珊珊,肖雪,樸勝華,郭姣.不同產(chǎn)地佛手指紋圖譜及模式識別研究[J].世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2017,19(05):820-824.版權(quán)歸原創(chuàng)作者所有。獵藥人轉(zhuǎn)載只為傳播中藥知識，不做商業(yè)用途，如不適合轉(zhuǎn)載，請后臺留言聯(lián)系編輯，本平臺將予以刪除處理。感謝原作者的辛勞研究與付出。

總結(jié)

以上是生活随笔為你收集整理的指纹图谱相似度评价软件_不同产地佛手指纹图谱及模式识别研究的全部內(nèi)容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問題。

如果覺得生活随笔網(wǎng)站內(nèi)容還不錯，歡迎將生活随笔推薦給好友。