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有關(guān)流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytometry，FCM)實(shí)驗(yàn)步驟中的固定和通透化，你需要了解什么？

進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)，如果你所有的靶標(biāo)均在外表面表達(dá)，那么可使用活細(xì)胞。但當(dāng)你靶向胞內(nèi)蛋白時(shí)，需依次進(jìn)行固定、通透細(xì)胞并用抗體和/或偶聯(lián)抗體對細(xì)胞進(jìn)行免疫染色。

固定會交聯(lián)細(xì)胞中的大分子并將靶蛋白鎖定到位。通透化使抗體能夠進(jìn)入胞內(nèi)間隙。關(guān)于固定、通透化的實(shí)驗(yàn)步驟，有一些注意事項(xiàng)。

- 1：

在www.cellsignal.cn 上可找到每種經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證的抗體的建議固定和通透化實(shí)驗(yàn)步驟。只需在搜索欄中輸入產(chǎn)品貨號便會看到產(chǎn)品頁。

- 2：

固定前，你的細(xì)胞需放在單細(xì)胞懸浮液中以確保讀數(shù)和分析準(zhǔn)確。如果你的原始材料是黏附細(xì)胞或組織，那么你需要用胰蛋白酶或其他蛋白酶徹底分離細(xì)胞。一旦你獲得單細(xì)胞懸浮液，便可用各流式細(xì)胞術(shù)試管繼續(xù)進(jìn)行固定、通透化和染色步驟，或者可以對大批量細(xì)胞進(jìn)行固定和通透化，并將它們分裝，用于后續(xù)分析。

- 3：

對于許多抗體，建議的固定劑包括甲醛，也就是多聚甲醛的含水單體形態(tài)。在通透化前固定細(xì)胞有助于盡量減少靶蛋白的丟失并保留信號轉(zhuǎn)導(dǎo)狀態(tài)。這一點(diǎn)在諸如使用磷酸化特異性抗體來對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活動進(jìn)行表征鑒定時(shí)尤為重要。

- 4：

固定后，確保徹底洗掉固定劑。這可避免細(xì)胞內(nèi)的蛋白過度交聯(lián)，并消除抗體通過殘余固定劑與非特異性靶標(biāo)交聯(lián)的風(fēng)險(xiǎn)。固定并清洗細(xì)胞后，便可以進(jìn)行通透化。

- 5：

一些抗體需使用某種特定的通透化試劑，而另一些則在使用多種試劑時(shí)效果相當(dāng)。你可以在cellsignal.cn 抗體產(chǎn)品頁上找到適合你的抗體的建議通透化試劑。CST經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證、針對胞內(nèi)靶標(biāo)的抗體大部分都適合甲醇通透化。甲醇等溶劑可更容易地進(jìn)入細(xì)胞核、線粒體和溶酶體等細(xì)胞器的內(nèi)部。在某些情況下，甲醇會影響表位結(jié)構(gòu)。這會對檢測產(chǎn)生積極或消極影響，具體取決于抗體和表位。皂素等去垢劑能更好地保留表位的天然結(jié)構(gòu)，但可能無法更容易地進(jìn)入。

總結(jié)

以上是生活随笔為你收集整理的bootstrap 悬浮固定_CST Tech Tips - 流式细胞术中如何固定和通透细胞？的全部內(nèi)容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問題。

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