結合并激活熒光染料的適體熒光RNA(FR)已用于對豐富的細胞RNA種類進行成像。然而，諸如低亮度和具有不同光譜特性的染料/適體組合的有限可用性的局限性，限制了這些工具在活的哺乳動物細胞和體內的使用。

最近，華東理工大學朱麟勇及楊弋共同通訊在Nature Biotechnology 在線發表題為”Visualizing RNA dynamics in live cells with bright and stable fluorescent RNAs“的研究論文，該研究開發了Peppers，一系列單體，明亮且穩定的具有熒光RNA，其最大發射范圍從青色到紅色。Peppers可以對活細胞中的各種RNA進行簡單而強大的成像，而對目標RNA的轉錄，定位和翻譯的干擾影響非常小。

定量分析單個細胞中蛋白質及其信使RNA的水平表明，翻譯受正常的酶動力學控制，但具有明顯的異質性。該研究進一步證明，Peppers可用于通過CRISPR展示對基因組基因座進行成像，實時跟蹤蛋白質-RNA鏈以及進行超分辨率成像?？偠灾?#xff0c;這些FR將是細胞RNA實時成像的有用工具。

RNA在細胞中表現出復雜的動力學，包括表達，降解，易位，剪接和其他化學修飾。因此，非常需要類似于熒光蛋白標簽來理解RNA的動態分子生物學。感興趣的RNA可以通過熒光原位雜交標記，或通過標記被特定酶識別的結構基序共價標記。不幸的是，這種技術需要細胞固定并且不適用于活細胞成像。具有工程化基序的RNA可以與熒光蛋白和特定RNA結合蛋白的融合物拴在一起。例如，MCP，PCP，λN或Cas。

Pepper530 RMFP的特性

在這些方法中，由于未結合的熒光蛋白融合物自由擴散，因此存在顯著的背景熒光，并且每個RNA最多需要48個綠色熒光蛋白(GFP)融合物才能獲得最佳信噪比。這種束縛蛋白的沉重負荷是否會影響RNA的定位，穩定性和行為仍有待確定。盡管存在這些缺陷，MS2系統還是當前活細胞RNA成像的金標準，被廣泛用于研究單分子水平的RNA行為。更直接地，目標RNA可以與結合熒光團的RNA適體融合并可視化。

擴大FR的光譜范圍

盡管已經認識到這種概念已有好幾年了，但是許多這些熒光團和熒光團-猝滅劑結合物在活細胞中具有顯著著的背景熒光和/或不易擴散跨質膜。Jaffrey和他的同事率先開發了GFP的RNA模擬物(RMFP)，它們是與GFP熒光團的非熒光類似物特異性結合并激活其熒光的適體。在活細胞中，這些熒光團顯示出大大減少的背景熒光，突出了RMFP信號本身。 RMFPs已成功地用于對幾種豐富的細胞RNA種類進行成像，并已被開發為代謝產物和蛋白質的傳感器。

使用Pepper的CRISPR展示對基因組基因座進行多色成像

盡管這些RMFP看上去簡單而有前途，但它們具有顯著的局限性，例如相對較低的亮度，僅綠色的可用性，有限的熱穩定性或光穩定性或多聚體性質，這可能會阻礙其廣泛用于活的哺乳動物細胞和體內的一般成像應用，尤其是成像mRNA，其豐度比核糖體RNA和轉移RNA低幾個個數量級。具有改善的細胞亮度，穩定性和最大范圍的熒光發射最大值(特別是在紅色區域)的RMFP仍然是理想的，但尚未實現。

在這里，研究人員開發了Peppers，一系列單體，明亮且穩定的具有熒光RNA，其最大發射范圍從青色到紅色。Peppers可以對活細胞中的各種RNA進行簡單而強大的成像，而對目標RNA的轉錄，定位和翻譯的干擾影響非常小。定量分析單個細胞中蛋白質及其信使RNA的水平表明，翻譯受正常的酶動力學控制，但具有明顯的異質性。該研究進一步證明，Peppers可用于通過CRISPR展示對基因組基因座進行成像，實時跟蹤蛋白質-RNA鏈以及進行超分辨率成像。總而言之，這些FR將是細胞RNA實時成像的有用工具。

參考消息：

https://www.nature.com/articles/s41587-019-0249-1

總結

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