Illumina輸出文件詳解

• • Illumina測序原理（next-seq-550）
  • • 基本過程
    • 基本概念
  • BCL文件（Base Call Files）
  • BCI文件（Base Call Index Files）
  • BGZF文件（Block GNU ZIP File）
  • BGZF.BCI（Block Compress Index，可能叫這個名字）
  • FILTER文件（簇過濾信息文件）
  • LOCS文件 （簇位置信息文件）
  • Fastq格式文件 （Illumina）

Illumina測序原理（next-seq-550）

基本過程

Illumina測序包裹文庫制備、簇生成、測序、數據分析四個過程。

• 文庫制備：主要是制作一些碎片化的核酸序列，并將這些碎片化的序列和接頭序列連接起來。接頭序列包括一段與測序芯片上的寡聚核苷酸（oligo）反向互補的一小段序列，同時如果需要也可以通過PCR插入一段index序列用于標記序列所屬的樣本。
• 簇生成：該過程主要是橋式PCR的過程。在芯片上有兩種寡聚核苷酸，首先被測序的單鏈DNA的接頭與其中一種寡聚核苷酸識別互補，隨后以被測序的單鏈DNA作為模板合成反向互補的DNA序列。合成完畢以后，進行核酸變性，洗去被測序的單鏈DNA。而后，被合成的DNA序列由于在3‘段的接頭序列中存在與第二種寡聚核苷酸的互補序列，因此可以與第二種寡聚核苷酸序列識別。識別以后，會根據模板連生成一段反向互補序列。重復上述過程，完成簇生成。最后會切去第二種寡聚核苷酸延伸出的單鏈DNA。
• 測序的過程即加入引物進行測序，核苷酸可以通過合成發出的熒光確定。具體原理參考illumina手冊。雙端測序則會在該過程結束后重新進行橋式PCR并切去第一種寡聚核苷酸延伸的單鏈DNA，并重新執行測序過程。
• 數據分析過程，使用illumina專用的Sequencing Analysis Viewer分析生成BCL、圖像等原始文件，再通過bcl2fastq即可獲得fastq序列并繼續后續分析。

基本概念

• 流動槽（flow Cell）：該名稱為Illumina的官方術語，也稱作芯片，為一次性用品。其表面遍布寡聚核苷酸。
• 泳道（lane）：一個流動槽有4個泳道。泳道指帶有專用輸入輸出端口的物理通道。
• 表面（surface）：流動槽會在頂面和底面兩個表面成像。一個小區的頂面成像后，該小區的底面會接著成像，之后會移至下一個小區。
• 每泳道測繪帶數（swaths per lane）：測繪帶是泳道中的一列小區。
• 相機片段（camera segments）：儀器使用6個相機對流動槽成像，為每個泳道成像3個片段。
• 每個相機片段的的每測繪帶小區數（tiles per swath per camera segment）：小區是流動槽上的區域，相機將其視為一個圖像。
• 小區（tile）：小區是流動槽上以相機的視野定義的小成像區域。

流動槽組件高輸出中等輸出

泳道	4	4
表面	2	2
每泳道測繪帶數	3	1
相機片段	3	3
每個相機片段的每測繪帶小區數	12	12
成像小區總計	864（相乘）	288（相乘）

注：泳道1和3（泳道對A）同時成像。泳道2和4（泳道對B）再泳道對A完成后成像。

注：相機編號為1-6。相機1-3對泳道1成像。相機4-6對泳道3成像。對泳道1和3成像后，成像模塊會沿x軸方向移動，以便對泳道2和4成像。

BCL文件（Base Call Files）

BCL文件是由Illumina測序儀生成的測序文件，包含測序的信息。包括簇數和堿基信息。

• 簇數：無符號32位整數（unsigned int, 4 Byte）表示。由開頭的4個字節存儲。
• 堿基信息：無符號8位整數（unsigned char, 1Byte）表示。低位0-1比特位（bit）表示堿基（00-A，01-C，10-G，11-T），2-7比特表示堿基的質量分數，向右移2位即表示為該堿基的質量分數。

注：整數在內存中表示時從高地址向低地址表示。18 18 AA 08（16進制）實際表示為08 AA 18 18，即需要倒序為真實整數。

注：bit位由左向右為7-0。

例：

地址數據（Hex dump）值

0x00000000-0x00000003	18 18 AA 08	145365016（08AA1818，簇數）
0x00000004	81（1000 0001）	01 -> C，1000 00 -> 32
0x00000005	80（1000 0000）	00 -> A，1000 00 -> 32
0x0000000C	55（0101 0101）	01 -> C，0101 01 -> 21
0x0000000F	3B（0011 1011）	11 -> T，0011 10 -> 14
……	……	……

BCI文件（Base Call Index Files）

本文件與bcl.bgzf.bci文件不同。本文件主要表征的是每個泳道中的每個小室中簇的數量，每個簇即對應一條Read。每條記錄由兩個無符號32位整數表示。其中低32位標識tile的編號，高32位標識小室中的簇的數量。

例：

地址數據（Hex dump）值

0x00000000-0x00000007	5D 2B 00 00 / 35 EE 09 00	11101（小室編號）/ 650805（簇數量）
0x00000008-0x0000000F	5E 2B 00 00 / D8 DF 09 00	11102 / 647128
0x00000010-0x00000017	5F 2B 00 00 / 00 BE 09 00	11103 / 638464
0x000006B8-0x000006BF	10 5B 00 00 / 60 3A 0A 00	23312 / 670304
……	……	……

小室編號規則：

• 表面：1表示頂面，2表示底面
• 測繪帶：1、2或3
• 相機：1、2、3、4、5或6
• 小區：01、02、03、04、05、06、07、08、09、10、11、12
• 如：小區編號12508表示頂面、測繪帶2、相機5和小區8

BGZF文件（Block GNU ZIP File）

該文件是BCL文件的壓縮文件，壓縮格式為BGZF格式，該格式與gzip格式兼容，可以使用gunzip命令或者7z解壓。該文件實際上由按照序列排列的GNU ZIP壓縮塊組成，每個壓縮塊均可表示一個獨立的gzip文件。即將gzip文件拼接成1個文件即是bgzf文件，擁有快速隨機讀寫的能力。每個gzip壓縮前后均不超過64KB。

• 每一個gzip塊的開頭序列為：1F 8B 08 04 00 00 00 00 00 FF 06 00 42 43 02 00；
• 每一個gzip塊的結束序列為：1f 8b 08 04 00 00 00 00 00 ff 06 00 42 43 02 00 1b 00 03 00 00 00 00 00 00 00 00 00；

開頭信息為：

主要：

FieldDescriptionTypeValue

ID1	gzip IDentifier1	uint8_t	31
ID2	gzip IDentifier2	uint8_t	139
CM	gzip Compression Method	uint8_t	8
FLG	gzip FLaGs	uint8_t	4
MTIME	gzip Modification TIME	uint32_t
XFL	gzip eXtra FLags	uint8_t
OS	gzip Operating System	uint*_t
XLEN	gzip eXtra LENgth	uint16_t

附加1：

FieldDescriptionTypeValue

SI1	Subfield Identifier1	uint8_t	66
SI2	Subfield Identifier2	uint8_t	67
SLEN	Subfield LENgth	uint16_t	2
BSIZE	total Block SIZE minus 1	uint16_t

附加2：

FieldDescriptionTypeValue

CDATA	Compressed DATA by zlib::deflate()	uint8_t[BSIZE-XLEN-19]
CRC32	CRC-32	uint32_t
ISIZE	Input SIZE (length of uncompressed data)	uint32_t

本文件的任意壓縮塊均包含上面的全部內容。

BGZF.BCI（Block Compress Index，可能叫這個名字）

需要注意的是這個文件與bci（Base Call Index Files）文件是不同的，本文件為BGZF壓縮文件的索引文件。但本文件與bci（Base Call Index Files）文件是存在對應關系的。與bci文件相同的是，本文件的總記錄數量與bci（Base Call Index Files）文件的記錄數量是相同的，每一條記錄均表示為一個小室（Tile）。由頭信息與記錄組成。

需要值得注意且極其重要的是，每一條記錄都對應的都是一個小室，且每個小室都由不止一個gz塊組成。每條記錄的低16位與高48位組成，高48位即本小室開始的gz塊在整個bgzf文件中地址。低16位表示該gz塊解壓后的數據塊中本小室開始的地址。

如：04 00 / 00 00 00 00 00 00，表示第一小室（如泳道1的編號11101小室）的起始gz塊的地址在整個bgzf文件中為0x00 00 00 00 00 00，04表示本小室在第一塊gz塊解壓后的地址0x04開始。

如：39 EE / B2 E3 02 00 00 00為第二條記錄，表示第二個小室的起始gz塊的地址在整個bgzf文件中為0x00 00 00 02 E3 B2，39 EE表示第二小室在這個gz塊解壓后的數據的地址0xEE 39開始。

例：

地址數據（Hex dump）值

0x00000000-0x00000003	00 00 00 00	0（頭信息）
0x00000004-0x00000007	D8 00 00 00	216 （頭信息，小室數量）
0x00000008-0x0000000F	04 00 / 00 00 00 00 00 00	4 / 0（記錄）
0x00000010-0x00000017	39 EE / B2 E3 02 00 00 00	60985 / 189362
……	……	……

FILTER文件（簇過濾信息文件）

本文件主要包含的是每個簇的是否被過濾的信息。其中0-12 Byte表示該文件的頭信息，包括頭、版本、簇數。后面信息則為記錄，每條記錄為1 Byte。

例：

地址數據（Hex dump）值

0x00000000-0x00000003	00 00 00 00	0（頭信息）
0x00000004-0x00000007	03 00 00 00	3（文件版本號）
0x00000008-0x0000000B	18 18 AA 08	145365016（08AA1818，簇數）
0x0000000C	00	False 未通過過濾，在Fastq的頭中用Y表示
0x00000130	01	True 通過過濾，在Fastq的頭中用N表示
……	……	……

LOCS文件 （簇位置信息文件）

本文件主要記錄的是每個簇所在的位置信息。其中0-12 Byte表示該文件的頭信息。后面每8 Byte為一條記錄，每條記錄包括x軸位置信息和y軸位置信息。

例：

地址數據（Hex dump）值

0x00000000-0x00000003	01 00 00 00	1 (Uint32) 頭信息
0x00000004-0x00000007	00 00 80 3F	1.0（Float32）頭信息
0x00000008-0x0000000B	EF E1 2F 02	36692463（022FE1EF，簇數）
0x0000000C-0x00000013	32 92 5B 43/21 EC 03 40	219.57（Float32，x軸坐標）/ 2.06 (Float32, y軸坐標)

坐標信息轉換到Fastq文件中時需要進行一定的轉換，具體轉換公式如下：

_pos = (Uint32)record_pos*10+1000.5

Fastq格式文件 （Illumina）

FieldDescription

@	每一條記錄的開始
instrument	設備號
run ID	系統運行編號
flow cell ID	流動槽編號
lane	泳道編號
tile	小區編號
x_pos	x軸坐標
y_pos	y軸坐標
UMI	[Optional] The UMI sequence (A, G, C, T, and N). When the sample sheet specifies UMIs, a plus sign separates the Read 1 and Read 2 sequences.[后接一個空格]
read	1/2分別表示單端或雙端中序列1或序列2，單端測序僅有1，雙端存在1和2
is filtered	Y-表示被過濾，N-表示未被過濾
control number	0—Control bits are not turned on.*
index sequence or sample number	[可選]接頭序列或者樣本的編號

第二行為堿基序列；

第三行為注釋，一般為+；

第四行為質量信息，為phred33格式表示。

總結

以上是生活随笔為你收集整理的Illumina输出文件详解的全部內容，希望文章能夠幫你解決所遇到的問題。

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